肿瘤源性骨桥蛋白诱导髓系抑制性细胞促进肿瘤免疫逃逸机制研究

Recently, accumulating evidence has shown that a population of cells with suppressive activity (known as myeloid-derived suppressor cells (MDSCs)) contributes to the negative regulation of immune responses during cancer and other diseases. However, the mechanism by which the population in tumor was induced remains largely unclear. Our preliminary work showed that the supernatant from lung cancer cell lines could effectively expand this population, and anti-osteopontin(OPN) antibody blocked this effect, albeit not to the OPN derived from other tissue or cells(N-OPN), suggesting that tumor-derived OPN(T-OPN) might mediate MDSCs generation, contributing to the tumor immune escape. To further characterize the role and molecular mechanism of OPN in the generation of MDSCs, we propose here to (1) define the phenotype and function of MDSCs from the patients and mice with lung cancer;(2) characterize the molecular mechanism of T-OPN in the generation of MDSCs by using the combination of RNA array, bioinformatics and RNAi techniques; (3) validate the difference of structure between T-OPN and N -OPN through two-dimension electrophoresis and mass spectrometry. Through this study we aim to elucidate the function and signalling mechanism of T-OPN in the generation of MDSCs, with the implication of the novel immune-therapeutic avenue for the lung cancer, even other tumors.

髓系抑制性细胞（MDSC）是近年来发现的一群骨髓来源的免疫抑制细胞，在多种肿瘤中发现MDSC比例显著增加，并在肿瘤免疫逃逸中发挥重要的作用，但肿瘤中这群细胞产生的机制尚不清楚。我们前期发现多株肺癌细胞的上清均可有效扩增MDSC，且这种扩增能被抗骨桥蛋白(OPN)的抗体阻断，而来源于正常组织的OPN（N-OPN）不具备这种功能。结果提示我们肿瘤来源的OPN（T-OPN）能通过扩增MDSC介导肿瘤的免疫逃逸。本课题拟从肺癌临床标本及小鼠肺癌模型两个层面，分析肺癌中MDSC的表型及功能；通过体外细胞实验及体内干预实验，阐明T-OPN诱导MDSC扩增及对肿瘤免疫逃逸的作用；进一步利用二维电泳和质谱技术，解析T-OPN与N-OPN结构的差异，找到T-OPN的受体及介导的信号通路，揭示T-OPN诱导MDSC扩增的机制；同时，本研究将为揭示肺癌发病机制提供新的线索和依据，为肿瘤的免疫干预提供新的策略。

髓系抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）是近年来发现的一群骨髓来源的免疫抑制细胞，大量研究表明其在肿瘤免疫逃逸中发挥重要免疫调节作用，但肿瘤中这群细胞产生的机制尚不清楚。骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）是一种磷酸化的分泌型糖蛋白，与肿瘤发生发展密切相关。有研究认为OPN的功能是多重的，既能影响宿主免疫的细胞功能，又能影响肿瘤侵袭中的转化细胞功能。OPN可以在转录和翻译后进行修饰，不同细胞来源的OPN可以有多种多样的结构特征，从而具备不同的生物学功能。本课题重点探讨肿瘤来源的OPN对MDSC扩增的影响。.以C57BL/6小鼠脾脏细胞为靶细胞，体外实验肺癌细胞3LL的上清可有效扩增MDSC的频率；体内实验小鼠皮下接种肺癌3LL细胞建立小鼠成瘤模型，分析MDSC的表型及功能，结果显示肺癌模型小鼠脾脏细胞中MDSC的频率显著增加。ELISA检测3LL细胞上清中OPN的表达水平明显高于正常肺组织上清。体内外实验中OPN抗体可以有效抑制MDSC频率的增加。转导短发卡结构质粒shRNA沉默3LL细胞中OPN的表达，转染后的3LL细胞做体内外实验，OPN的下调抑制了脾脏中MDSC频率，同时肺癌细胞的成瘤能力明显下降，肿瘤发生发展迟缓，表明肿瘤来源的OPN（T-OPN)具有扩增MDSC的功能，而来源于正常组织的OPN（N-OPN）不具备这种功能。OPN存在四种不同的剪切变体形式，并且不同形式在3LL中水平不同，但对MDSC的扩增作用无显著差异。实时定量PCR技术及流式细胞技术检测，相较于正常小鼠脾脏细胞，模型组MDSC高表达CD44，并且体外实验抗CD44抗体阻断后，MDSC频率明显下降，说明T-OPN通过与MDSC表面CD44结合发挥作用。通过细胞增殖及凋亡实验阐明MDSC频率增加的机制，结果表明MDSC是通过细胞转化实现扩增。.因此，T-OPN具有扩增MDSC的功能，其作用机制是与MDSC表面CD44结合发挥作用，扩增MDSC来介导肺癌肿瘤细胞的免疫逃逸。我们的研究结果将为揭示肺癌发病机制提供新的线索和依据，为肿瘤的免疫干预提供新的策略。