miR-145-lncRNA-ADD3调控网络在胆道闭锁纤维化形成过程中的机制研究

Biliary atresia (BA) is a progessive fibro-obliteration of intra- and extra-hepatic bile duct disorder that leads to end-stage hepatocirrhosis. The exact mechanism for BA is still in blur, while hepatic stellate cells (HSCs) may participate in this progress with an indefinite role. Previously, we discovered that miR-145 could participate in BA liver fibrosis by down-regulating ADD3 expression. We also found that lncRNAs were differential expressed in BA compared to control groups.In this study, we will further confirm the role of miR-145-lncRNA-ADD3 pathway in activation of HSCs and BA as the followings: 1. The expression level of miR-145 in activated HSCs was measured through RT-qPCR and Western blot. 2. The lncRNAs which competitively bind to miR-145 were fished out by RNA sequence. 3. The regulation role of target lncRNAs on ADD3 was veirfied by specific RNAi. 4. It will be confirmed that biliary epithelium transformation to myofibroblasts causing biliary fibrosis was induced by this miR-145-lncRNA-ADD3 pathway in vitro and in vivo. After finished, the mechanism of progressive hepatic fibrosis in BA will be better understood and a new target for further therapeutic strategy on BA will be found.

胆道闭锁（Biliary atresia,BA）是新生儿期肝内、外胆管进行性纤维化、消失、最终导致终末期肝硬化的一种疾病。BA发生的具体机制尚不明确，肝星状细胞与这一过程密切相关，但其扮演的角色尚不清楚。前期研究中我们发现miR-145可以改变下游ADD3的表达水平，参与胆道闭锁纤维化的过程，lncRNAs在BA和正常的肝组织中的表达有明显差异。本研究拟在前期基础上进一步明确miR-145-lncRNA-ADD3这一信号通路在肝星状细胞激活和BA中的作用。具体如下：1.肝星状细胞激活过程中miR-145的表达情况。2.寻找可能参与miR-145竞争性的目标lncRNAs。3.验证目标lncRNAs对ADD3的调控作用。4.在体内、外水平明确这一调控作用是否可诱导胆管上皮细胞向肌成纤维细胞转化导致胆管纤维化。项目的完成将会进一步明确BA的发生机制，为临床上最终治疗BA提供理论依据。

本课题着重研究miR-145-lncRNA-ADD3信号通路在胆道闭锁肝纤维化中的机制探讨，选取与肝纤维化密切相关的肝星状细胞作为体外细胞模型，采用基因沉默、基因高表达、高通量测序、细胞转染验证等技术，围绕该信号通路深入研究其对胆道闭锁肝纤维化的影响。实验结果：1、对胆道闭锁肝组织及对照组肝组织进行RNA测序，发现存在2086个差异性表达mRNA（DEmRNA）和184个差异性表达lncRNA（DElncRNA），主要富集于免疫和炎症相关的生物学过程和代谢途径。TYROBP、CXCL8、PLEK、TLR8 和 CCR5 是 PPI 网络的五种中枢蛋白。确定了参与 BA 相关肝纤维化的关键基因和 lncRNA，为了解肝纤维化机制提供了新途径；2、基于细胞转染，构建5组LX-2细胞（microRNA-145过表达组、microRNA-145干扰下调组、microRNA-145干扰对照组、microRNA-145过表达对照组、正常细胞组）进行全转录组测序分析，与前期肝组织测序结果中发现的被注释lncRNA共交集后，提示lncRNA JPX 、TUG1、SNHG1、ADD3-AS1存在明显差异性表达。后续qPCR验证发现：microRNA-145过表达时，lncRNA ADD3-AS1表达随之下调；抑制miR-145时，ADD3-AS1随之上调，呈负调控；3、构建lncRNA ADD3-AS1高表达组、高表达对照组、低表达组、低表达对照组、空白对照组，CCK-8试验发现lncRNA ADD3-AS1促进LX-2细胞增生，流式细胞技术发现lncRNA ADD3-AS1同时可抑制LX-2细胞凋亡；4、划痕实验显示lncRNA ADD3-AS1明显增强LX-2细胞的迁移能力，Transwell 试验也显示lncRNA ADD3-AS1明显增强LX-2细胞的侵袭能力；5、蛋白质印迹提示lncRNA-ADD3-AS1可明显增加下游α-SMA表达水平。综上揭示：lncRNA ADD3-AS1通过影响肝星状细胞增殖、凋亡、迁移侵袭等功能，提示microRNA-145-ADD3-AS1-ADD3信号通路可能在胆道闭锁患儿发生肝纤维化的发病机制中发挥一定作用，为日后lncRNA ADD3-AS1作为监测BA肝纤维化的潜在诊断标志物或作为该疾病的治疗靶点提供研究方向。