染色体10q24微重复引起先天性手足分裂畸形的分子机制

The latest studies indicated that changes of chromatin structure can cause hunman diseases. Microduplication of human 10q24 genomic region has been associated with congenital split-hand/foot malformation (SHFM), but the molecular mechanism is unknown. In a pedigree with SHFM, we found that a 500kb microduplication in 10q24 region cause the formation of an extra FBXW4-LBX1 hybrid gene. The 3D map of the human genome indicated that FBXW4 and nearby FGF8, the key regulator of limb morphogenesis, comprise a topologically associating domain (TAD), which determines the spatio-temporal expression of FGF8 in developing limb bud. We propose that the FBXW4-LBX1 hybrid gene forms a new TAD and causes SHFM. To prove this hypothesis, a genomic duplication SHFM mouse model will be established by targeted meiotic recombination. The capture-HiC and 4C-Seq experiments will be performed to examine the formation of new TAD in the mouse model. Then we will investigate whether the new TAD drives the ectopic expression of LBX1 in developing limb bud and by what mechanism LBX1 impairs the limb bud development and causes SHFM. Finally, we will validate this mechanism in patient-derived specimens. This study will reveal for the first time that the chromatin conformation change can cause human congenital SHFM.

最新研究表明，染色体构象改变可造成人类疾病。10q24微重复导致先天性手足分裂畸形（SHFM），其分子机制不明。在一个SHFM家系中，我们发现10q24区域500kb微重复导致额外FBXW4-LBX1杂合基因产生。染色体构象图谱显示，FBXW4与相邻肢体发育关键基因FGF8共同构成一个染色体拓扑关联域（TAD），调控FGF8在胚胎肢芽的表达。据此，我们提出假说：10q24微重复产生的FBXW4-LBX1杂合基因通过形成新TAD导致SHFM。为验证该假说，本课题将利用靶向减数分裂重组技术建立基因组微重复疾病小鼠模型；用染色体构象靶向捕获Hi-C及4C-Seq方法研究疾病小鼠是否产生新TAD；研究新TAD是否造成LBX1在胚胎肢芽异位表达进而干扰正常肢体发育。最后，我们将在病人组织样本中验证这一机制。研究将首次揭示染色体构象变化引起先天性手足分裂畸形的关键机制。

先天性手足分裂畸形是一种严重的出生缺陷，是以肢端正中轴指(趾)发育不全、而剩余指(趾)呈现不同形式融合为特征的先天性肢端畸形，表现为手/足中央裂隙、并指（趾）、指（趾）骨及掌（跖）骨发育不全。10q24微重复可导致先天性手足分裂畸形，其分子机制不明。我们的前期研究发现10q24区域的微重复导致了额外的FBXW4-LBX1杂合基因产生。重复的FBXW4可能与相邻肢体发育关键基因FGF8形成新染色体拓扑关联域（TAD），影响FGF8在胚胎肢芽的表达，导致SHFM。但目前研究进展缺少基因组微重复疾病小鼠模型。.本研究建立了10q24微重复产生的FBXW4-LBX1杂合基因定点敲入的疾病小鼠模型，基于患者外周血/组织样本的染色质构象Hi-C的关键技术，在此基础上探索先天性手足分裂畸形的致病基因与关键分子机制。.课题首先通过同源重组原理，采用ES细胞打靶的方式，构建FBXW4-LBX1杂合基因定点敲入的嵌合小鼠，对其基因型、表型进行鉴定、分析。然后摸索建立了利用患者外周血进行染色质三维构象Hi-C建库的方法以及用于Hi-C测序的手术样本组织预处理体系。同时，扩大了先天性手足分裂样本量，验证10q24微重复的发生频率和重复基因片段。通过对先天性手足分裂畸形样本致病基因分析、全外显子测序灵敏性及特异性验证，提出全外显子测序可作为中国人手足分裂畸形的首选基因筛查手段。研究了新发突变位点如TP63、HOXD8、UBA2导致的手足分裂畸形机制，分析了其与胚胎肢芽发育可能存在的共同生物学通路。.综上所述，本研究首次构建了FBXW4-LBX1杂合基因定点敲入嵌合小鼠，为先天性手足分裂畸形疾病的研究提供了新的技术支持，阐述了手足分裂畸形的关键致病基因与主要致病通路。