补肾活血汤激活lncRNA PVT1促进MSCs迁移修复骨折的分子机制

It is very vital for fracture repair to recruit adequate mesenchymal stem cells to fracture area. There are various noncoding RNAs involved in migration of stem cells. However, those concrete targets and mechanisms are unknown. Our previous work found that BuShenHuoXueTang can enlarge the expression of long noncoding RNA PVT1, induce migration of MSCs and accelerate fracture healing. But the effect of PVT1 in migration of MSCs and the molecular mechanism of BuShenHuoXueTang how to activate long noncoding RNA PVT1, induce chemokine expression and accelerate fracture repair need to be deeply investigated. So, the approaches, for example, flow cytometry, ELISA, qRT-PCR, western blot, cell chemotactic experiment, dual luciferase reporter, RIP, RNA Pull-down, CHIP and immunohistochemical analysis will be used in the project. By aid of the clinic patient`s samples, cell, and animal fracture model, we will investigate PVT1 how to induce chemokine expression, promote migration of MSCs through miR-503-5p from epigenetic modification and post-transcriptional level and regulatory mechanism of BuShenHuoXueTang. Taken together, It will offer not only a novel regulation mode for migration of MSCs mainly on lncRNA→ miRNA→ mRNA, but also a new research idea and theoretical basis of the molecular mechanism study for TCM therapy of BuShen and HuoXue in fracture repair of elderly people.

招募足够数量的MSCs至骨折端对骨折修复至关重要。多种非编码RNA参与干细胞迁移，然其作用靶点和机制不详。我们前期工作发现补肾活血汤促进lncRNA PVT1表达，诱导MSCs迁移，加快骨折愈合。但PVT1在MSCs迁移中的作用以及补肾活血汤如何激活PVT1、诱导趋化因子表达、促进骨折修复的分子机制仍需深入探讨。故本项目拟运用流式细胞、ELISA、qRT-PCR、Western blot、细胞趋化实验、双荧光素酶报告基因、RIP、RNA Pull-down、CHIP、免疫组化等技术手段，借助临床病人标本、细胞、动物骨折模型，从表观遗传修饰、转录后水平研究PVT1如何通过miR-503-5p诱导趋化因子表达，促进MSCs迁移以及补肾活血汤的调控机制。本项目提出以lncRNA→miRNA→mRNA为主的MSCs迁移调控模式，为中医补肾活血法促进老年骨折修复的分子机制研究提供全新思路和理论依据。

招募足够数量的MSCs至骨折端对骨折修复至关重要。多种非编码RNA参与干细胞迁移，然而其作用靶点和机制不详。我们前期工作发现补肾活血汤促进lncRNA PVT1表达，诱导MSCs迁移，加快骨折愈合。但PVT1在MSCs迁移中的作用以及补肾活血汤如何激活PVT1、诱导趋化因子表达、促进骨折修复的分子机制仍需深入探讨。因此，本项目拟运用流式细胞、ELISA、qRT-PCR、Western blot、细胞趋化实验、双荧光素酶报告基因、RIP、RNA Pull-down、CHIP等技术手段，借助临床病人标本、细胞、动物骨折模型，从表观遗传修饰、转录后水平研究PVT1如何通过miR-503-5p诱导趋化因子表达，促进MSCs迁移以及补肾活血汤的调控机制。. 根据研究结果，我们得出：（1）补肾活血汤的有效成分棕榈酸能够促进大鼠BMSCs的迁移。其作用可能是通过促进CXCR4基因表达实现的；（2）补肾活血汤能够促进MSCs向成骨细胞分化；（3）PVT1在MSCs迁移中发挥重要作用，补肾活血汤通过激活lncRNA PVT1促进MSCs迁移、骨折修复。其机制可能通过海绵吸附miR-503-5p，从而增加下游CXCL10的基因表达；（4）补肾活血汤的临床疗效观察表明，补肾活血汤能够促进老年性股骨粗隆间骨折术后康复，避免围手术期隐性失血引起的并发症。. 综上，本项目具有重要的科学意义。首先，以中医补肾活血法为理论指导，从间充质干细胞迁移角度出发，采用细胞实验、动物实验及临床疗效观察三种探索方式，运用pull-down、荧光定量 PCR、Western Blot、transwell迁移实验等技术，初步发现补肾活血汤促进骨折后间充质干细胞迁移的分子机制，为骨折治疗提供理论依据；其次，从分子、细胞、动物三个不同水平揭示补肾活血汤促进MSCs迁移、加快骨折修复的机制，为骨修复与再生提供新的治疗靶点与研究基础；其三，补肾活血汤不仅促进MSCs向成骨分化，还有利于预防老年股骨粗隆间骨折患者围手术期隐性失血诱发的并发症发生，促进骨折康复，减轻患者的费用负担，为补肾活血汤多维度治疗骨折提供更多科学依据；最后，补肾活血汤中的中药单体棕榈酸能够促进间充质干细胞的增殖、迁移，为骨组织修复与再生的药物研究提供新的思路。