启动子上的开放染色质在小RNA激活（RNAa）机制中的作用研究

RNA activation (RNAa), a promising measure to achieve positive regulation, refers to the activation of gene expression by designing small RNA molecules that target specific promoters. As the mechanism underlying RNAa remains unclear, the methods for design and application of RNAa are uncertain. In our previous study, we found that small activated RNA(saRNA) could change the positions of nucleosomes and form open chromatin in fibroblast, and further suggested the presence of a common mechanism underlying the change in chromatin structure in RNAa, despite large variations at the molecular level. The current study aims to verify this assumption of the universal nature of positions of nucleosome changed by saRNA, and the action of “open chromatin” in RNAa. We plan to construct vector models expressed in mammalian cells, to analyze the impact on RNAa in different cell types by studying the interaction between “open chromatin” induced by small activated RNA (saRNA) and “open chromatin” regulated by ubiquitous chromatin opening elements (UCOEs), in addition to its impact on RNAa efficiency by studying the interaction between UCOEs and “CpG islands and TATA box”, which are associated with the formation of open chromatin in RNAa. This study would not only help clarify the role of open chromatin in RNAa, but also facilitate the application of RNAa in vectors used in transgenic expression.

RNA激活（RNAa）是指设计小RNA通过靶向启动子激活基因表达，有望成为通用的基因正调控手段。由于RNAa的机制仍不清楚，RNAa的设计和应用具有很大的不确定性。我们的前期研究发现成纤维细胞中“小激活RNA（saRNA）通过改变启动子上核小体位置形成开放染色质”，并提出启动子上形成开放染色质是RNAa的共性规律的推论。本项目旨在从小saRNA改变核小体位置的普适性，以及启动子上形成的差异开放染色质在RNAa中的作用两方面验证该推论。拟通过构建哺乳动物细胞表达载体模型，分析染色质开放元件（UCOE）与saRNA相互作用调控形成的“开放染色质”在不同细胞中对RNAa的影响，以及研究影响RNAa中开放染色质形成的“CpG岛和TATA box”与UCOE之间的互作对开放染色质及RNAa激活效率的影响。本项目有助于阐明启动子上开放染色质在RNAa机制中的作用，奠定RNAa在表达载体中的应用基础。

RNAa是指设计双链小RNA (dsRNA)通过靶向启动子激活基因的表达，这种小RNA称为saRNA( small activated RNA)。由于RNAa机制仍然不清楚，所以saRNA仍然难以被广泛应用。本项目旨在从更宏观的染色质结构层面整合RNAa机制研究中的分子基础，研究小RNA激活基因转录的共性规律和染色质机制。通过构建独立的表达载体模型，研究UCOE与小激活RNA（saRNA）共同调控的启动子上形成的“开放染色质”在不同细胞中变化及对RNAa的影响，阐明启动子上形成的染色质开放区域在RNAa中的作用。通过研究UCOE、启动子上调控序列（如TATA box 和CGI）及saRNA相互作用形成的差异开放染色质，及其产生的RNAa的激活效应，阐明启动子上差异开放染色质的形成、特点、及在RNAa中作用规律。. 本项目经过四年的实施，综合利用GC甲基化酶分析法（NOMeSeq）和核小体删除分析法，获得了大量的实验结果和数据，为较为系统地研究了UCOE，MAR，小RNA靶向启动子区形成的开放染色质等及pHiC31系统整合区的开放染色质的特点及形成规律提供了数据和证据。在分析这些数据的基础上提出了核小体删除区作为基本单元如何实现开放染色质调节基因表达的理论模型，首次提出核小体删除和重塑在启动子上形成大删除区、中大删除区、小删除区、大堵点、正常核小体等基本概念，及阐述他们之间的相互作用调节高效表达和抑制的规律；验证了“小RNA靶向启动子诱导开放染色质的形成的假说”。本项目获得的重要结果还包括提出开放染色质区核小体并非绝对删除，而是以合理而有规律的布局调控基因表达的科学推断，阐述了DNA甲基化与核小体在启动子上相互作用激活基因表达的过程。.本项目获得的理论模型，科学判断和发现的现象及规律，有助于进一步认识基因在染色质层面的调控机理和小RNA激活机制奠定基础。为基因高效表达应用基础理论增加了新的知识，为小RNA在临床的应用以及基因工程和基因治疗中高效表达载体应用奠定基础。