间充质干细胞调控EMT机制改善胆道闭锁胆管纤维化的实验研究

Recent years' study shows that biliary atresia (BA) is autoimmune disease which triggered by viral infection, and the the main performance is biliary tract destructive inflammation. However, its pathogenesis has not been elucidated, and the collagen continue composuring which leading liver fibrosis.Research showed that TNF-α,TGF and some other immune related cytokines could induce biliary epithelium EMT,changed it into a muscle fibroblasts, resulting in bile duct fibrosis. On the basis of preliminary research of hepatic stem cells reversing liver fibrosis,we found that the mesenchymal stem cells(MSCs) can differentiate into hepatocytes and bile duct cells, at the same time, which has the function of regulating immune function(down-regulated TGF) and improving liver microenvironment. We hypothesize that: MSCs could affect the EMT by regulating immune related factors and improve biliary fibrosis caused by BA. This topic first observe therapeutic effect of the MSCs for the treatment of BA using of BA animal model and then study the role of MSCs in EMT by using cell culture, Western blot and so on methods.Finally clarify that mechanism of the role of MSCs in EMT by HGF/c-Met pathway using the method of RNA interference and provide new ideas and theoretical basis for clinical treatment.

近年，主要认为胆道闭锁（biliary atresia, BA）是由病毒感染介导的自身免疫性疾病，表现为破坏性胆道炎症性病变，最终导致胶原沉着和肝纤维化，然而其发病机制尚未阐明。研究表明TNF-α、TGF等免疫相关细胞因子可诱导胆道上皮发生EMT，使其转变为肌成纤维细胞，最终引起胆管纤维化。基于我们前期采用肝脏干细胞逆转不同背景的肝纤维化的基础上，发现间充质干细胞（MSCs）具有调节免疫功能（下调TGF）和定向分化为胆管细胞和肝细胞的功能，改善肝脏微环境，我们推测：间充质干细胞可通过调控EMT而改善胆道闭锁引起的胆管纤维化。本课题拟首先利用胆道闭锁动物模型评价MSCs治疗胆道闭锁的效果；其次利用细胞共培养、Western blot等方法观察MSCs在胆管上皮细胞EMT中的作用；最后运用细胞RNA干扰等方法明确MSCs通过HGF/c-Met通路调控EMT，为临床治疗BA提供新思路和理论依据。

胆道闭锁（biliary atresia, BA）被认为是由病毒感染介导的自身免疫性疾病，表现为破坏性胆道炎症性病变，最终导致胶原沉着和肝纤维化。本项目根据肝纤维化分级、小胆管增生的程度、肝组织炎症和汇管区胆栓程度进行综合判断，建立了一种新的BA肝脏病变程度的评价方法。. 本项目完成了整体动物实验：建立BA小鼠模型，采用腹腔内注射1x106骨髓间充质干细胞（BMMSC），7天后重复注射，连续注射两周期，14天后取血清、肝脏等组织进行观察。结果提示移植BMMSC可改善BA小鼠肝功能，降低肝脏MDA，提高GSH、SOD等抗氧化水平；并且肝纤维化及EMT相关指标α SMA, COL1A1, TGF β1 ，TNF α等均有下降，其机制可能与逆转EMT相关。. 本研究完成了胆道闭锁患儿肝组织N-cadherin、E-cadherin、vimentin等EMT相关指标的检测，发现上皮间质转化相关蛋白在BA患儿肝组织中的表达量显著高于对照组患儿肝脏，提示上皮间质转化相关蛋白可能参与BA患儿肝纤维化的发生发展。在体外实验中，我们采用TGF-β(5ng/ml)刺激小鼠AML-12细胞，采用realtime PCR检测细胞上皮性标志物E-cadherin和α-catenin，结果显示， E-cadherin和α-catenin的表达降低。以上体内外实验证实胆管细胞的EMT机制参与了BA的病变进程。. 本项目首次采用体外增压的方法模拟胆道梗阻胆管系统高静水压状态，并发现胆管上皮细胞形态改变，并发生EMT现象，Thbs1为关键因子。胆道梗阻可导致脉管系统压力增高，使肝脏内环境紊乱。进一步研究证实胆管细胞在压力增高的情况下增生，大量增生的胆管细胞由“受害者”转变成“帮凶”，通过Thbs1上调TGF β1，两者可能形成正反馈，诱导胆管细胞EMT，从而促进胆管纤维化。本研究阐明了在压力条件下胆管细胞发生EMT，丰富了胆道闭锁胆管纤维化的理论基础，为发现新的治疗靶点奠定了理论基础和实验基础。. 本课题全面完成研究计划，发表学术论文8篇（标注资助），并培养博士研究生1名。硕士研究生3名。