铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作用下PBS及其共聚物的降解途径研究

脂肪族聚丁二酸丁二醇酯(PBS)及其共聚物因含有易水解酯键，在微生物的作用下能够通过酶催化作用发生分子主链降解。本项目针对微生物降解聚酯的机制尚不清楚的问题，以微生物为基本研究对象，从寻求铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）对PBS及其共聚物的最佳降解条件出发，以柱层析、HC-MS、FT-NMR、FT-IR、XPS等分离表征手段，重点分析PBS降解过程中的中间降解产物，同时采用盐析、SDS-PAGE、1-DE、2-DE、蛋白质数据库信息比对等生物化学和生物信息学的研究方法，对铜绿假单胞菌降解PBS及其共聚物过程中所产生的解聚酶进行分离、纯化，并确定酶的种类和功能，结合PBS及其共聚物的中间降解产物的分析，推测其降解途径。为研究高分子的生物降解提供一条新的思路和途径，为实现提高微生物对PBS的降解速度并实现降解速度可控提供理论依据。

本研究以聚丁二酸丁二醇酯(PBS)为唯一碳源，采用滤纸片法从西安郊区土壤中分离出一种可有效降解PBS的菌株。通过对该菌株的形态、生理生化特征的研究以及16S rDNA序列对比分析，该菌株的生理生化特征与铜绿假单胞菌属相似，且其16S rDNA 序列与Pseudomonas aeruginosa 39016 contig00492的核苷酸序列同源性99%，结合生理、生化指标鉴定结果，进一步确定确定该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudanonas aeruginosa)，其在GenBank中的登录号(accession number)为JQ411250。通过单因素实验和正交实验进一步对其产酶条件进行优化，结果表明，该菌株代谢脂肪酶的最优组合水平为：蔗糖0.5%，硫酸铵0.05%，硫酸亚铁0.005%，复配乳化剂 0.5%，培养温度29 ℃，转速120 rpm，接种量5%，培养基初始pH值9.0。该菌株在最优产酶条件下对PBS-co-BDGA薄膜和PBS-co-CHDMS薄膜的降解实验表明，PBS-co-BDGA薄膜比PBS-co-CHDMS薄膜降解效果明显，PBS-co-BDGA薄膜降解呈先快后慢，最后趋于稳定。降解过程中聚合物的晶型并未发生改变，结晶度略有增大，降解首先是由聚合物的非晶区开始降解。DGA的加入增加了聚合物的亲水性，更有利于该微生物的进攻，而CHDM的引入使PBS-co-CHDMS的刚性增加，链段的柔顺性下降，因此本实验所选菌株对具有柔顺性的PBS-co-BDGA有更好的识别能力，更容易降解。采用脂肪酶催化降解，进一步分析了分子链中功能性基团的位置对脂肪酶降解与底物识别的影响。PBS-co-BDGA的非酶水解与总降解性均高于PBS-co-DGS，且随着DGA含量的增加而增加。PBS-co-CHDMS的降解性能高于PBS-co-BCHDA。随着共聚单体比例的增加，PBS-co-CHDMS与PBS-co-BCHDA的非酶水解均有所减弱，PBS-co-CHDMS的酶降解逐渐增强，而PBS-co-BCHDA的酶降解随非酶水解的影响逐渐减弱。聚酯分子主链中二元酸部分结构的改变对降解性能的影响更显著。PBS-co-CHDMS-co-CL降解过程中主要发生分子链无规断裂。CL结构的引入可促进PBS共聚酯的水解，分子链中含有CHDM与CL结构的部分更易被脂肪酶识别。