拟南芥VSP蛋白的晶体结构和催化特性研究

VSP是拟南芥中一类具有酸性磷酸酶活性的防御蛋白，参与了茉莉酸诱导的植物防御反应，其酸性磷酸酶活性与抗虫活性相关。VSP蛋白在序列上具有特征motif DXDXT，因此属于HAD家族（the haloacid dehalogenase superfamily）中的细菌B类酸性磷酸酶亚家族。已有的研究表明，酸性磷酸酶DXDXT 中的第一个D在催化中作为亲核试剂，与底物上的磷酸基团形成共价键，但这种亲核取代反应存在3种不同的化学途径，HAD家族成员也存在催化特性和功能的多样性。由于VSP蛋白与细菌酸性磷酸酶的氨基酸序列同源性低，并具有二价铜离子激活的特性，因此其晶体结构的解析是了解其催化特性的关键。本课题将克隆表达和纯化拟南芥VSP蛋白，进行晶体生长，通过对其酶学性质的研究，晶体结构的测定和分析，来阐明VSP蛋白酸性磷酸酶的催化途径和参与植物防御的作用机制。

拟南芥的VSP蛋白（VSP1和VSP2）是一种与植物防御相关的重要蛋白，参与了茉莉酸诱导的植物信号转导途径。还有研究表明，VSP1可能通过与FLOR1蛋白一起和转录因子AG形成复合物，参与了花发育调控。氨基酸序列分析表明，VSP是一种酸性磷酸酶，属于HAD家族中的细菌非特异性酸性磷酸酶类，具有特征DXDXT序列。 VSP1和VSP2具有86％序列同一性，但与HAD家族的其他成员的序列同源性很低，只有8－14％。因此，对VSP蛋白酸性磷酸酶活性和晶体结构的研究将有助于了解这类蛋白在植物防御及发育调控中的作用。. 在截去了N端信号肽序列后，拟南芥VSP1和VSP2在大肠杆菌中获得了重组表达，纯化后用坐滴气相扩散法进行了蛋白晶体生长条件的筛选。同时对这两个蛋白的酸性磷酸酶活性和底物特异性进行了测定。结果表明，VSP1和VSP2的酸性磷酸酶活性都需要二价阳离子（如镁离子）的参与；它们的活性可被钒酸盐和钼酸盐所抑制，但不受无机磷的影响；VSP1和VSP2对实验所测定的生理底物没有明显的特异性。经过筛选，我们获得了VSP1的蛋白晶体和衍射数据。初步晶体学分析表明，VSP1晶体属于C2空间群，一个不对称单位包括2个单体分子。由于PDB库中无同源结构作为分子置换的模型，我们制备了VSP1的硒代甲硫氨酸衍生物晶体。通过单波长反常散射，获得了相位信息，解析了其晶体结构。结果表明，VSP1单体包括一个α/β核心结构域和一个帽子结构域。尽管VSP1和HAD家族其他成员的氨基酸序列同源性很低，其核心结构域的折叠方式和参与催化的氨基酸残基却具有保守性。比较特殊的是，VSP1的帽子结构域参与了蛋白的二体相互作用。通过比较VSP1和细菌酸性磷酸酶P4的晶体结构发现，除了二体相互作用方式的不同，在底物结合位点也存在不同，这可能导致了二者底物特异性的不同。作为植物VSP蛋白的第一个晶体结构，本项目的研究结果为HAD家族的催化功能和途径的多样性提供了信息，也将为这类蛋白进一步的功能探索提供了结构基础。