半滑舌鳎NK-lysin基因的表达调控及功能研究

水产养殖业的健康发展及水产品的食用安全迫切需要开发新型的抗菌物质来替代传统的抗生素药物。NK-lysin是一种由T淋巴细胞和NK细胞产生的抗菌肽，具有广谱抗菌活性。基于此，本项目拟在前期研究的基础上，利用分子生物学、微生物学和免疫学手段，研究我国重要经济鱼类半滑舌鳎NK-lysin基因的表达、调控与功能。研究内容包括分析NK-lysin基因结构和表达特征；确定NK-lysin的启动子并筛选、鉴定其调控因子，分析调控因子的作用机制；分析研究NK-lysin的生物学活性和抗菌谱，确定NK-lysin与抗菌相关的关键活性位点以及抗菌机制。同时，构建NK-lysin的真核表达系统，探索NK-lysin在鱼类病害防治中的应用可能。本研究的成功将加深我们对半滑舌鳎免疫机制的了解，并为鱼类病害防治提供新的途径。

为了保障水产养殖业的健康发展，必须尽快研发新型的抗菌物质来替代传统的抗生素药物。本项目系统研究了我国重要经济鱼类半滑舌鳎NK-lysin基因的表达、调控与功能。研究结果表明：(1) NK-lysin cDNA包含长30 bp的5’- UTR，408 bp的开放阅读框，215 bp的3’-UTR和由19个腺嘌呤组成的poly-A尾巴， NK-lysin DNA结构包含5个外显子和4个内含子；NK-lysin在不同组织的表达水平由低到高为：肠道<心脏<鳃<肝<脑<脾<头肾；NK-lysin的表达受到鳗弧菌和肿大病毒的诱导；(2) NK-lysin的衍生肽NKLP27具广谱抗菌活性，对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、荧光假单胞菌、鳗弧菌和哈维氏弧菌，以及革兰氏阳性菌藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和海豚链球菌均有明显的杀菌效果。其中荧光假单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌和海豚链球菌是水产养殖业的重要致病菌。其对于大肠杆菌、荧光假单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和海豚链球菌的最小抑菌浓度分别是4μM，8μM，2μM，2μM，1μM，4μM和4μM，最小杀菌浓度分别是16μM，32μM，8μM，16μM，4μM，16μM和16 μM；NKLP27的活性位点包括C-末端的5个氨基酸残基；（3）NKLP27对鳗弧菌的杀菌机制为：NKLP27通过破坏细胞膜的完整性和细胞结构而进入细胞质中，并能导致鳗弧菌基因组DNA降解，最终导致细菌死亡；（4）NKLP27可显著降低鳗弧菌和肿大病毒对半滑舌鳎的侵染能力；针对其机制研究发现，NKLP27导入鱼体后可以上调免疫相关基因包括IL-1β, IL-8, CsCCK1, CsCXCe1, TLR9, Myd88, CsISG15和CsG3BP在内的表达水平，这些基因均参与宿主天然免疫中对细菌和病毒侵染的防御；（5）NK-lysin在半滑舌鳎体内进行过量表达可引起促炎基因和淋巴细胞激活基因的表达水平显著上升，并能降低鳗弧菌和肿大病毒对半滑舌鳎的侵染能力。这些研究结果有助于我们深入了解半滑舌鳎的免疫机制和抗菌肽的作用机制；并为水产养殖业的病害防治提供了新的途径。. 以上研究结果共发表SCI论文3篇，均发表于本领域主流学术期刊；申请国家发明专利2项，超额完成了预期目标。