‘无子瓯柑’雄性不育的细胞及分子机理研究

创造无核柑橘新品种是产业发展的需要；柑橘无核突变具有重要的经济和研究价值。本项目以瓯柑无核突变体及其野生型为试材，从细胞学和分子层面深入研究'无子瓯柑'雄性不育的机理。通过形态学和显微结构的观察，划分小孢子发育过程的分期并阐明各个时期的发育特点；通过对小孢子母细胞减数分裂行为的观察与统计，探明'无子瓯柑'小孢子母细胞减数分裂过程中出现的异常现象；取小孢子母细胞减数分裂前后一段时期的花药，构建'无子瓯柑'及其野生型的SSH文库，点杂交筛选差异表达的克隆，测序后进行生物信息学分析，确定与雄性不育性状紧密相关的候选基因；采用Real-time PCR对差异基因的表达进行验证，进而利用RACE技术获得候选基因的全长。本研究旨在探明'无子瓯柑'雄性不育的细胞学机理，克隆与雄性不育性状相关的候选基因，探讨'无子瓯柑'雄性不育的分子基础，为采用激素调控或基因工程手段创造无核柑橘种质奠定基础。

无核果实以其食用方便而倍受人们的青睐，培育和创造无核柑橘新品种是当前柑橘品种选育的趋势之一。研究柑橘无核性状的形成机理有助于我们认识无性繁殖条件下果树芽变的规律及其调控机制，为创造无核柑橘种质奠定理论基础。本研究以‘无子瓯柑’及其野生型为试材研究其雄性不育的机理。采用半薄树脂切片、扫描电镜、透射电镜等方法对其花药发育过程和花粉形态进行观察。结果表明，有子瓯柑花粉粒饱满，‘无子瓯柑’花粉粒多干瘪、畸形。 ‘无子瓯柑’花药发育在四分体时期开始出现异常，单核期异常加剧，小孢子能形成花粉壁，但细胞质收缩、解体，最终只剩余空瘪的花粉壳。在成熟花粉粒时期，‘无子瓯柑’花药的绒毡层附近有大量的脂类物质残存，而有子瓯柑绒毡层附近无脂类物质残存，营养物质被花粉粒利用充分。收集‘无子瓯柑’发育各时期的花蕾（N），混样抽提总RNA，并以有子瓯柑各时期混样（Y）为对照，进行数字基因表达谱（Digital Gene Expression, DGE）分析。共筛选到105个差异表达基因，其中，上调表达9个，下调表达96个。经BLASTn比对，与注册的功能已知基因相匹配的基因有61个，其中，上调表达基因占5%，下调表达基因占95%；与注册的未知功能基因匹配的基因有44个，其中上调占14%，下调占86%。显著性富集分析表明，DGEs共涉及100个生物反应过程、51种基因功能、25个细胞位置（结构）及35个生物代谢途径。采用同源序列法并结合RACE技术，克隆获得‘无子瓯柑’脂转移酶（CsLTP）基因和脂氧合酶（CsLOX）基因的全长cDNA序列，其中，CsLTP cDNA全长667bp，1个开放读码框，编码215个氨基酸，与脐橙、粗柠檬的脂转移蛋白的相似性达到95%和60%；CsLOX cDNA全长2915bp，一个开放读码框，编码895个氨基酸，与粗柠檬、杨树的脂氧合酶的相似性达到99%和51%。 实时定量表达分析显示，CsLTP在‘无子瓯柑’花粉四分体时期的表达显著高于有子瓯柑，并从花粉粒形成期开始显著下降。CsLOX的表达则在小孢子母细胞时期、四分体时期、花粉粒成熟期和开花期均显著高于普通瓯柑，只有在花粉粒形成期显著下降。‘无子瓯柑’小孢子母细胞减数分裂过程的不正常，及其脂类相关基因表达异常而引起的花粉发育过程中油脂转运与氧化的异常，可能成为其花粉败育的原因。