美国红鱼TFPI衍生肽抗菌机制研究

It is imperative to find new antimicrobials to replace antibiotic drugs in order to keep the healthy development of aquaculture in China. Our previous study has proved C-terminal derived peptides of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) of Sciaenops ocellatus possess bactericidal activity. However, the action mechanism of it remain unknown. In this study, we will firstly detect the bactericidal spectrum of the derived peptides; then, by means of microscopy, flow cytometry analysis and gel electrophoresis mobility shift assay, we will analyze the effects of the derived peptides on permeability, integrity and structure of cell membrane of target bacteria; furthermore, we will detect the effects of the derived peptides on integrity and structure of genomic DNA, study the interaction between genomic DNA and derived peptides, and identify the key active sites of the derived peptides, all which will help to illuminate the action mechanism of the derived peptides; at last, we will analyze the immunostimulation effect of the derived peptides, and explore its application in the fish disease control. The success of this study will deepen our understanding of action mechanism of fish TFPI derived peptides, and provide a new approach for fish disease control.

我国水产养殖业的健康发展迫切需要开发新型抗菌物质来替代抗生素药物。申请人前期研究发现美国红鱼组织因子途径抑制物 (tissue factor pathway inhibitor, TFPI) C-末端衍生肽具很强的抗菌功能，但是该衍生肽通过何种方式来实现其抗菌功能？为探究其抗菌机制，本项目拟在此基础上，借助于光谱学分析、流式细胞仪检测、电镜观察和凝胶滞缓实验等技术，系统测定衍生肽的抗菌谱，分析衍生肽对靶细菌细胞膜渗透性、完整性和细胞结构的影响，明确衍生肽对靶细菌核酸完整性和DNA结构的影响，分析衍生肽和靶细菌核酸的相互作用，鉴定衍生肽与抗菌相关的关键活性位点，阐明衍生肽杀伤靶细菌的机制，揭示衍生肽在不同鱼类中的免疫刺激效应并探索其在病害防治中的应用可能。本项目将首次深入研究美国红鱼TFPI衍生肽的抗菌机制，研究结果将有助于阐明鱼类TFPI衍生肽的抗菌机理，并为鱼类病害防治提供新的途径。

组织因子途径抑制物 (Tissue factor pathway inhibitor, TFPI) 是一类丝氨酸蛋白酶抑制剂，有TFPI-1和TFPI-2两种类型。研究证实，TFPI-1和TFPI-2的C末端区域可以自发断裂，产生的片段具有广谱抗菌活性。本项目研究了美国红鱼和半滑舌鳎TFPI-1和TFPI-2的4种衍生肽（美国红鱼TFPI-1衍生肽TO17，美国红鱼TFPI-2衍生肽TO24，半滑舌鳎TFPI-1 衍生肽TC24和半滑舌鳎TFPI-2衍生肽TC38）的抗菌、抗病毒活性、抗菌机制及其在病害防治中的应用，结果如下：四者均具有广谱抗菌活性，并且该活性不依赖于宿主血清，其靶细菌均包括Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus和Vibrio vulnificus，此外，TO24的靶细菌还包括Vibrio litoralis, Vibrio ichthyoenteri和Vibrio scophthalmi；TC38的靶细菌还包括Vibrio litoralis, Vibrio ichthyoenteri和Vibrio parahaemolyticus。而且，四者均对传染性脾肾坏死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV）具抗病毒活性。对抗菌机制的研究表明，四者在与靶细菌作用的过程中既可以结合在细菌表面，也可以穿透进入细胞质中，导致细菌DNA和RNA部分或完全降解，最终导致细胞死亡；不同之处在于于，TO17、TO24和TC24在和靶细菌作用的过程中破坏了细胞膜的完整性，而TC38在和靶细菌作用的过程中基本保留了细胞膜的完整性。基于TC38的这一特性，后续申请了国家自然科学基金面上项目“半滑舌鳎TFPI-2衍生抗菌肽在制备新型灭活疫苗中的应用研究（31872607）”并获得了资助。对四者的体内效果研究表明，其在鱼体内均可以降低细菌或病毒对鱼体的侵染能力。此外，TO17还可提高巨噬细胞的NO水平和杀菌活性。这些结果表明，TO17、TO24和TC24和TC38是一类高效新型抗菌肽，在病害防治中具有良好的应用前景。此外，对其抗菌机制的研究也为相关研究提供了新的视角。.上述研究结果共发表SCI Ⅰ区 研究论文5篇，获授权发明专利1项，超额完成了研究任务。