铜绿假单胞菌降解多环芳烃的基因组学研究

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs）是环境中普遍存在的一类难降解的危险性"三致"有机污染物。利用微生物降解PAHs是当前国内外环境污染治理的热点，许多其他方法难以处理的PAHs均能被一种微生物或一个微生物群体全部或部分降解。本项目拟以降解PAHs的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DN001为研究对象，利用荧光素酶基因操纵子（luxCDABE）为报道基因建立一套以启动子文库为基础的新型微生物基因组基因表达监测系统，在全基因组水平研究PAHs对基因组中所有基因表达的作用，并辅以蛋白质组学技术和生物信息学手段，在整体水平系统地了解细菌降解PAHs途径的代谢酶和基因簇组成，探索PAHs的细菌降解机理，为菌株的基因工程改造和优化提供理论指导。同时为充分利用微生物代谢途径多样性解决环境污染问题提供理论基础和资源储备。

多环芳烃(PAHs)是一类广泛分布于环境中的含有两个以上苯环的有机污染物，具有毒性、生物蓄积性和致癌性，并能在环境中持久存在；尤其是高分子量的多环芳烃(HMW-PAHs) ，具有较强的疏水性，因此很难通过传统的物理化学方法进行彻底降解。利用微生物降解法消除污染环境中的PAHs化合物，是一种高效、环保、经济的方法。.本项目在获得一株能以萘、菲、荧蒽等多环芳烃为唯一碳源和能源生长的铜绿假单胞菌DN001且该菌株对荧蒽有较强的降解能力（在14天内对500mg/L初始浓度的荧蒽降解率为93.2%）的基础上，通过转座突变技术构建了含有18000多个克隆的随机转座突变体库，从全基因组水平系统筛选和定位了与荧蒽降解的相关基因，获得了16株不能以荧蒽为单一能源和碳源生长的转座突变体；通过随机PCR实验，定位了13个发生突变的基因；尤其是hisA、hisD1、leuC1、purD及AXYL_00207基因的转座突变体，基本生长与野生型相比没有明显变化，但是对荧蒽降解的中间产物水杨酸和龙胆酸的利用能力降低，暗示这些基因可能是与荧蒽降解直接相关的基因。目前还在通过重复实验进一步复筛，以期获得更多与高分子量多环芳烃降解相关的基因。.与此同时，本项目利用SDS-PAGE和2-DE方法检测了菌株DN001在荧蒽诱导下细胞全蛋白的表达变化，并对差异极其显著的蛋白点进行了质谱分析和鉴定，已确定了8个蛋白质点的氨基酸序列，其中诱导后新表达的蛋白有5个，诱导后表达量显著提高的蛋白有3个。利用鉴定出的蛋白同源序列设计简并引物，在该菌株中扩增出了2个蛋白的编码基因，序列比对结果显示，分别与Pseudomonas aeruginosa PA7中的亮氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-丙氨酸结合蛋白2（LIVTA-BP2）和类铁蛋白结构域结合蛋白（ferritin-like domain-containing protein）的编码基因有94%和88%的同源性，进一步验证了该菌株中确实存在与荧蒽降解密切相关的同源基因，它们的编码蛋白在荧蒽降解过程中起着非常重要的作用，为进一步阐明该菌株的荧蒽降解代谢机理提供了研究基础。