Erythrobacter litoralis新型金属β-内酰胺酶的耐药特性、晶体结构及催化机制研究

Our former studies on a marine bacterium, Erythrobacter litoralis, revealed a gene encoded for beta-lactamase II (Elbla2) showed an unexpected similarity with NDM-1 (New Delhi metallo-beta-lactamase) gene which makes the host bacterial strain easily dispatch the last-resort antibiotics known as carbapenems and cause global concern. In this study, we first apply bioinformatics approaches in the construction of three dimensional structure of Elbla2 to predict the catalytic active sites. Then study the antibiotic resistance and catalytic mechanisms of Elbla2 by heterologous expression and purification. Studies of the structure features and inhibitors are based on the analysis of the crystal structure of Elbla2. This work plays an important role in the study of the mechanisms of antibiotic resistance in marine bacteria and the evolution of the antibiotic resistance genes in the marine ecosystem.

前期工作中我们发现了海洋细菌Erythrobacter litoralis编码的Elbla2蛋白与“超级细菌”的新型金属内酰胺酶NDM-1具有最高的同源性且对碳青霉烯类抗生素耐药。本项目拟通过生物信息学方法解析Elbla2的基因特征和氨基酸理化性质，预测三维结构并确定相关酶活性位点，进而通过克隆表达纯化重组蛋白，首次探索海洋细菌金属内酰胺酶 (MBLs)的耐药特性、酶促动力学、光谱学和热力学特征，深化MBLs在海洋细菌中生理生化作用中的认识，并通过对Elbla2晶体结构的解析首次阐明海洋细菌MBLs的结构特异性以及抑制剂的抑制作用机理，通过比较海洋细菌和陆生细菌同源蛋白的作用机理、结构特征及进化差异，拓展海洋细菌蛋白结构学的认知。从多层次的研究水平上揭示海洋细菌的耐药机制，对海洋生态系统的耐药和进化研究有重要意义。

海洋细菌Erythrobacter litoralis HTCC 2594基因组编码的ElBla2是目前发现的与临床上非常重要的金属β-内酰胺酶NDM-1氨基酸序列相似度最高的蛋白(56%)。本项目以ElBla2为对象，首次通过异源表达和纯化，获得了有催化活性的Elbla2重组蛋白;对Elbla2的抗生素底物最小抑菌浓度和底物特异性进行了测定，探索了Elbla2作为金属β-内酰胺酶的酶促动力学特性，并且通过与临床细菌中金属β-内酰胺酶的酶促动力学常数的比较，深化了对海洋细菌金属β-内酰胺酶的生理生化作用的认识；同时，采用生物信息学手段，从氨基酸序列上对Elbla2和其他金属β-内酰胺酶进行了比对和分析，明确了Elbla2的家族分类，并且基于蛋白质同源建模和二级结构比对，预测了Elbla2相关金属结合位点和酶活性位点；最后，通过基因组学分析elbla2的产生菌E. litoralis HTCC 2594基因组中和基因转移相关的移动元件，对elbla2是否具有在菌株间转移的能力进行了评估，并基于16SrRNA分析和比较基因组学分析，提出了E. litoralis HTCC 2594作为疑似新种的建议。本项目为揭示海洋细菌新型金属β-内酰胺酶的酶学性质、结构特征及进化差异提供了研究基础，为进一步对海洋生态系统的耐药和进化研究提供了新策略和新方法。