无核椪柑胚囊败育的分子基础研究

无核是柑橘的重要经济性状，是柑橘育种的主要目标。由于柑橘本身多胚、杂合度高和童期长的特点，利用传统育种方法来培育无核品种费时费力。本项目以胚囊高度败育的无核椪柑品种'丽椪2号'和其有核母株为材料，结合抑制消减杂交（SSH）和cDNA-AFLP分析，分离鉴定与柑橘胚囊败育相关的差异表达基因，克隆测序后通过序列相似性比对推测其功能；利用实时定量RT-PCR分析候选基因在胚囊败育期间基因表达量的变化，进一步利用RACE技术获得目标基因的cDNA全长，并通过生物信息学工具进行功能预测。本研究是在前期'丽椪2号'胚囊败育细胞学研究的基础上，进一步利用基因差异显示技术来分离鉴定与柑橘胚囊败育相关的基因，初步了解无核椪柑胚囊败育的分子基础，并为今后利用基因工程进行柑橘无核育种奠定基础。

利用抑制减法杂交（SSH）结合高通量测序技术（RNA-Seq）来筛选椪柑胚囊败育相关基因，初步了解椪柑无核形成的分子调控机制，为今后利用基因工程进行无核柑橘育种奠定基础。构建有核和无核椪柑胚囊发育双向消减文库，共获得7540个cDNA克隆，其中正向4200个、反向3340个；随机挑取2400个克隆进行测序，共得到2106个有效序列，经EST cluster分析，获得1091个UniESTs，其中包括727个singlets和364个contigs。应用BLAST2GO软件进行功能归类，其分子功能主要涉及催化活性、转移酶活性、结构分子活性、蛋白结合、核酸结合、翻译因子活性、氧结合等方面。同时，我们也利用高通量测序RNA-Seq技术对两种椪柑样品不同开花时期子房样品cDNA文库进行表达谱测序，将原始测序数据比对到甜橙基因组参考序列，对21459个基因的表达量进行了分析，基于公共数据库，94.6%的基因得到了注释。通过比较2个样本间的数据从而筛选出106个差异表达基因，其中74个基因上调，32个基因下调。将所有差异基因序列提交BLAST进行同源性搜索，其中48个基因与已知功能基因有较高一致性，其余58个基因与未知蛋白或未鉴定蛋白调控基因序列有较高同源性。这些同源功能基因涉及锌指蛋白、蛋白结合、种子储藏蛋白、磷脂酶、转录因子、水通道蛋白、前体蛋白、蛋白激酶、赤霉素受体蛋白、热激蛋白等。GO功能分类发现，这些基因的分子功能主要归类为蛋白结合、水解酶活性、离子结合、转移酶活性、磷脂酶活性、运输等。通过对所有21459个表达基因进行Pathway富集分析，结果显示有14668个基因分布在KEGG的32个代谢途径中，其中差异表达基因主要富集在植物激素信号转导、淀粉和糖代谢、次生代谢物生物合成等几个途径。通过SSH和RNA-Seq两种方法的结合，并通过后续的生物信息学分析，我们发现了一些二者结果之间具有相似功能的基因，包括转移酶激活蛋白和水通道蛋白等。挑取25个功能基因进行实时定量RT-PCR分析，结果显示基因的表达模式与SSH、RNA-Seq所获得的结果基本一致。我们的研究发现了一些调控椪柑胚囊败育的功能基因，为今后深入揭示椪柑无核性状形成的分子机制奠定了基础。