基于ERβ-自噬途径对ROS/NLRP3信号通路的负调控探讨柴胡皂苷d抗肝纤维化作用机制

Recent studies have shown that NLRP3 inflammasome may be the key factor for the development of organ fibrosis. Estrogen receptor β (ERβ) induced autophagy can inhibit the development of fibrosis by down-regulating reactive oxygen species (ROS) generation which is the upstream signal of NLRP3 activation. However, the role of NLRP3 in hepatic fibrosis and the correlation of NLRP3 and fibrotic key cells have not been reported yet. Our previous studies show that saikosaponin-d can suppress hepatic stellate cells (HSCs) activation and ROS production by up-regulate ERβ expression of HSC-T6 cells. It is an effective drug for treating liver fibrosis, thus we suggest that saikosaponin-d may be a NLRP3 inhibitor. Therefore, vitro and vivo models of liver fibrosis will be adopted in this research to investigate the regulative effects of saikosaponin-d on ERβ-induced autophagy and ROS-NLRP3 signal pathway, moreover the correlation between the pathway and HSC activation or hepatocytes epithelial-mesenchymal transition (EMT). We aim to solve the following problems: ①to verify the key role of NLRP3 inflammasome in hepatic fibrosis; ②to clarify the relationship between ERβ pathway and HSC activation or hepatocytes EMT; ③ to demonstrate that the suppressive effects of saikosaponin-d on ROS-NLRP3 signal pathway, HSC activation and hepatocytes EMT is mainly attributed to its regulation of ERβ-induced autophagy; ④ the above results can provide the experimental evidence for exploring the prevention and treatment of liver fibrosis, particularly for searching the new targets and mechanisms of the effective chinese medicine monomer.

研究发现NLRP3炎性体可能是器官纤维化发生发展的关键因子，ROS是NLRP3活化的上游信号，ERβ诱导的自噬可下调ROS抑制纤维化发展。但NLRP3在肝纤维化中的作用以及与纤维化关键细胞间的关系尚不清楚。前期工作表明，柴胡皂苷d能上调HSC细胞ERβ，抑制ROS生成和HSC活化，具有良好的抗肝纤维化作用，推测SSd可能是NLRP3的抑制剂。为此，本项目采用细胞培养和肝纤维化动物实验，探讨ROS-NLRP3与HSC活化、肝细胞EMT的关系，以及ERβ诱导的自噬对ROS-NLRP3信号通路及下游靶基因的影响，在此基础上进一步探讨SSd抗肝纤维化机制。拟证实：①NLRP3炎性体在肝纤维化中的作用；②NLRP3与HSC活化、肝细胞EMT之间的相关性；③SSd可通过调节ERβ-自噬/ROS-NLRP3通路发挥抗肝纤维化作用。为探索肝纤维化防治、对疗效显著的中药单体新药靶及机制提供实验依据。

肝纤维化是一个动态的病理过程。及早干预肝纤维化至肝硬化的进程，打破肝硬化发生发展的死亡链成为肝病研究领域的难点与热点。研究发现NLRP3炎性体可能是器官纤维化发生发展的关键因子，而线粒体ROS可能是NLRP3活化的关键上游信号。但NLRP3在肝纤维化中的作用以及与纤维化关键细胞间的关系尚不明确。课题组前期工作表明，柴胡皂苷d能上调HSC细胞ERβ，抑制ROS生成和HSC活化，具有良好的抗肝纤维化作用，因此推测SSd作为ROS抑制剂亦有可能抑制其下游NLRP3炎性体活化。为此，本项目采用细胞培养和肝纤维化动物实验，探讨ROS-NLRP3与HSC活化、肝细胞损伤的关系，以及雌激素受体在SSd抑制抗纤维化作用中所扮演的角色，在此基础上进一步探讨SSd做为一种新型植物雌激素的抗肝纤维化机制。研究结果表明：①NLRP3炎性体在肝纤维化形成过程中的持续活化，在这一过程中有重要作用；②NLRP3与HSC活化、肝细胞损伤有密切关系，而线粒体来源的ROS可能是导致NLRP3活化的关键因素；③SSd可通过抑制ROS-NLRP3通路发挥抗肝纤维化作用。④在动物水平通过ERαflox/flox、ERβflox/flox小鼠，及细胞水平采用ERα特异性阻断剂MPP，ERβ特异性阻断剂THC对雌激素受体两亚型进行阻断，发现SSd的抑制ROS-NLRP3通路的作用被ERβ阻断剂或基因敲除所逆转，提示SSd是通过ERβ发挥下游效应的。本课题的完成，不仅对肝纤维化的分子生物学机制做出探讨，而且对发现SSd可能是柴胡调经、保肝抗炎的共同药理学物质基础，解释柴胡在中医临床多病症的应用及柴胡的中医归经理论提供一些现代药理学的理论和实验支持，同时，也对发现SSd新的药理作用以及作用靶点，对SSd在抗肝维化临床应用方面提供实验依据。