内质网应激在糖尿病动脉粥样硬化中的作用机制及槲皮素干预效果研究

心血管并发症是糖尿病致残致死的主要原因，病理基础是动脉粥样硬化（AS）。内质网应激（ERS）在糖尿病AS发生发展过程中起重要作用，它可能作为多种应激过程的共同通路，广泛地参与了糖尿病AS的形成。本实验室前期的研究发现槲皮素对糖尿病具有一定的防治效果，但其对糖尿病AS的作用并不明确。本课题拟采用apoE-/-小鼠经高脂联合小剂量STZ腹腔注射建立糖尿病AS模型，探讨糖尿病促AS发生发展的机制，特别是ERS在其中的作用。其次通过槲皮素的干预，观察其能否防治糖尿病AS的发生发展，以及对ERS的作用。同时开展细胞实验，观察ERS在葡萄糖胺条件下血管内皮细胞损伤和巨噬细胞吞噬胆固醇中的作用；通过槲皮素预处理后，研究其是否通过调节细胞的ERS相关分子来改善相关细胞的损伤和功能。该研究的结果将为寻找糖尿病AS治疗的新靶点，也为槲皮素作为防治糖尿病心血管并发症的临床营养治疗提供充分的科学依据。

本研究采用15 mmol/L的葡萄糖胺诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）损伤模型。实验分为：正常对照组，甘露醇等渗对照组（15 mmol/L），阳性对照组（5 μg/ml 衣霉素），葡萄糖胺模型组及槲皮素不同浓度干预组。同时，采用内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）激活剂衣霉素预先激活ERS通路后再按上述分组干预。通过ELISA法检测细胞上清中ICAM-1，VCAM-1，ET-1等含量，流式细胞仪及TUNEL法检测细胞凋亡情况，Real-time PCR和Western blot法等检测ERS和炎症相关通路mRNA和蛋白的表达，酶法测定细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量，油红O染色观察巨噬细胞荷脂情况等，来探讨HUVEC细胞功能及凋亡情况，RAW264.7细胞凋亡和胆固醇积聚情况及ERS相关分子的表达情况。结果显示，葡萄糖胺能明显增加HUVEC细胞上清中ICAM-1和ET-1水平，促进HUVEC细胞凋亡，加速RAW264.7细胞胆固醇积聚，增加泡沫细胞的形成；并能促进HUVEC细胞和RAW264.7细胞中ERS相关蛋白的表达。槲皮素（主要是10和20 μmol/L）能明显降低HUVEC细胞上清中ICAM-1和ET-1水平，减少HUVEC细胞凋亡，改善RAW264.7细胞胆固醇积聚情况，减少泡沫细胞的形成；并抑制了HUVEC细胞和RAW264.7细胞中ERS相关蛋白的表达。上述结果表明，葡萄糖胺能通过激活ERS促进和加重血管内皮细胞损伤，加速巨噬细胞吞噬胆固醇；适当浓度的槲皮素可能通过抑制ERS相关通路来减轻炎症应激及凋亡，最终改善血管内皮细胞损伤及巨噬细胞吞噬功能。该结果将为寻找糖尿病动脉粥样硬化的新靶点，也为槲皮素作为防治糖尿病心血管并发症的临床营养治疗提供了一定的科学依据。