闹羊花中具有离子通道调节作用的新颖结构二萜化合物的研究

Collect 70 kg of TCM "NaoYangHua". Obtain the abundant component and enrich the trace diterpenoids selectively via chemical screen and combination of mutiple chromatography technique. The fraction containing trace diterpenoids will be further seperated into 20-30 sub-fractions by flash chromatography. Bioactive fractions and inactive fractions will be identified by screening on ion channel models. Get the UV and MS data of all the compounds and locate the non-UV absorptable components by LC-UV-ELSD and LC-MS/MS analysis. Conduct systematic separation on the bioactive fractions through preparative LC-UV or LC-UV-RID. As to the inactive fractions, only separate the novel diterpenoids that have not been obtained by our group. Obtain 40-50 diterpenoids, determine their structures by morden spectrum and chemical method. Screen the isolated diterpenoids on ion channel models and study the structure-activity relationship (SAR). Test the potent compounds on animal analgesic models. Obtain 1-3 promising lead compounds with both in-vitro and in-vivo activities which would contribute the drug discovery.

采集中药闹羊花70kg，通过化学筛选结合多种色谱技术的组合应用，快速获取（去除）其中含量较高的二萜成分,在此基础上定向富集微量二萜类成分；对富集的含微量二萜化合物的部位，利用闪式色谱快速分为20-30个组分；通过离子通道活性筛选，确定活性组分和非（弱）活性组分；对各组分进行LC-UV-ELSD和LC-MS/MS分析，获取其中化学成分的紫外和质谱信息，并确定无紫外吸收二萜成分的分布；针对所含成分的结构特点（有无紫外吸收）采用制备型LC-UV或LC-UV-RID对活性组分进行系统分离，对非（弱）活性组分则结合LC-MS/MS定向分离尚未获得的新型二萜类成分；获取40-50个二萜类化合物，利用近代波谱和化学方法，确定它们的结构，并进行离子通道活性筛选，总结初步的构效关系。对具有较强离子通道活性的量大的化合物进行整体动物镇痛实验，优选出1-3个具有体内外活性的新型先导化合物，为新药创制奠定基础。

闹羊花，又名羊踯躅为杜鹃花科杜鹃花属植物。有大毒，也是一种常见的中草药。在我国传统医学上曾作为麻醉、镇痛剂使用，目前临床用于治疗风湿性关节炎、跌打损伤等。为了深入研究闹羊花镇痛作用的物质基础，课题组采用活性追踪锁定有效部位，并从镇痛有效部位RMY30中发现了2个主要药效物质：化合物14和15。这两个化合物的半数抑制剂量（ID50）分别在46.9和72.7 μg/kg，其镇痛活性是吗啡的5-8倍。但同时毒性也较大，半数致死剂量（LD50）分别是271.0 (179.0-350.0, 95%置信区间) 和1791.0 μg/kg (1324.0-2175.0, 95%置信区间), 选择指数（SI = LD50 / ID50）分别是5.8和24.6。鉴于这两个化合物具有非常强的镇痛活性，课题组对其进行了初步的药效和毒性研究。 我们经过系统的镇痛活性评价，发现化合物14和15不仅对急性疼痛有较强的抑制作用，同时对炎症性和慢性神经性疼痛也具有显著的作用，活性均强于阳性对照药，且呈剂量依赖性。此类化合物的镇痛作用机制尚不明确，但我们通过实验证实：化合物14和15对小鼠的镇痛作用不能被非选择性阿片受体阻断剂纳洛酮所逆转，间接证明其作用靶点不在阿片受体。这两个强效镇痛二萜以及其他一系列具有镇痛作用的二萜的发现，首次阐明了闹羊花这一古老镇痛中药的药效物质基础。.此外，课题组采用HPLC-MSn技术对羊踯躅的根、花和果实中具有镇痛作用的二萜组分进行了全面的化学筛选，针对其中的二萜类成分进行了定向富集和分离。共从中分离鉴定了159个化合物，其中91个为新化合物，包括4个新骨架化合物。首次发现具有C环缩环-D环扩环新型骨架的木藜芦烷二萜mollanol A，该化合物具有激活xbp1转录因子的活性。首次发现化合物rhodomollins A and B，具有一种C14发生迁移的新型木藜芦烷二萜骨架，其中rhodomollin B具有中等强度抗流感病毒活性，IC50为19.24 μM。首次发现了1个经过多次裂环的新骨架二萜mollolide A，在20mg/kg剂量下显示出显著的镇痛活性。以上研究结果大大丰富了木藜芦烷型二萜的结构多样性，为此类化合物的深入研究奠定了基础。