谷氨酰胺酶C的O型糖基化修饰在非小细胞肺癌细胞中的作用及机制

Glutaminase C (GAC) plays a critical role in cancer cell metabolism, which can promote cancer cell growth and supply many intermediate substrates for cancer cell division. In our recent studies, we found that GAC is highly expressed in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells and the growth of NSCLC cells depends on glutamine and GAC activity. However, the exact mechanism is not well understood. Thus, we performed a GAL4-based yeast two-hybrid screening using GAC as the bait. SCA10 was successfully selected and verified via co-immunoprecipitation and GST pull-down assay, which can regulate the O-GlcNAc-modification via binding O-linked β-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) transferase (OGT), leading to a detectable increase of several O-linked GlcNAc-modified proteins as reported. Therefore, we will reveal the molecular mechanism of O-GlcNAc-modification of GAC upon SCA10 recruiting OGT which activated by hexosamine biosynthetic pathway and glucose. In addition, we will elucidate the biological functions of SCA10 coupled with glucose metabolism and glutaminolysis on NSCLC cell growth, proliferation, migration, invasion and tumorigenicity in nude mice. In summary, our studies will provide theory support and new research direction for clinical diagnosis and therapy of NSCLC.

谷氨酰胺酶C（GAC）在肿瘤细胞代谢过程中发挥重要的作用，为细胞分裂提供所需的多种中间底物，并能促进肿瘤细胞生长。我们发现，GAC在多种非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系中高表达，而NSCLC细胞生长依赖于谷氨酰胺和GAC的活性，但具体的调控机制尚不明确。因此，我们通过酵母双杂交筛选GAC相互作用蛋白，并利用免疫共沉淀和GST pull-down实验最终验证并确定了SCA10。 SCA10能稳定GAC的蛋白水平但不影响其mRNA水平。有研究证实SCA10通过结合OGT调控细胞内的O型糖基化水平，进而提高细胞内一些蛋白的稳定性。据此，本项目将揭示SCA10招募OGT对GAC进行O型糖基化修饰的分子机制，阐明葡萄糖和氨基己糖生物合成途径（HBP）通过SCA10偶联谷氨酰胺代谢对NSCLC细胞生长、增殖、迁移和侵袭以及裸鼠成瘤性等生物学功能的影响，为临床诊疗提供理论支持和新的研究方向。

谷氨酸代谢在非小细胞肺癌（NSCLC）发生发展中具有关键作用，其关键限速酶GAC已成为癌症治疗的有效靶点，难而，GAC活性的调控机制知之甚少。我们通过酵母双杂交筛选到小脑共济性失调10型蛋白（ataxin10）是GAC的一个新的相互作用蛋白，通过免疫共沉淀和GST pull-down实验揭示Ataxin10能直接结合GAC。Ataxin10不影响GAC的表达水平，但能抑制NSCLC细胞中GAC的酶活。通过相互作用位点的筛查发现Ataxin10作为接头蛋白，其氨基端结合GAC，而羧基端结合O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（OGT），导致GAC的S95位点发生O型糖基化修饰。体外细胞实验显示Ataxin10能促进NSCLC细胞的生长、增殖和迁移，而裸鼠体内实验揭示Ataxin10促进NSCLC异源移植瘤的生长，并且依赖于GAC的O型糖基化修饰。此外，我们在临床病理样本中也发现Ataxin10的表达在NSCLC组织中显著低于癌旁组织。研究表明内皮细胞异常激活和功能障碍是肿瘤转移的重要因素，因此，我们进一步探索Ataxin10在内皮激活中的作用及分子机制。Ataxin10在内皮细胞和组织中有较高的表达，内皮细胞的激活能显著性抑制Ataxin10的表达。Western blot和qRT-PCR实验显示Ataxin10能明显抑制内皮细胞黏附因子VCAM-1和炎性因子（MCP-1、CXCL-1、CCL-5和TNFα）的表达，从而显著性降低对单核细胞的黏附和炎症反应。机制上，Ataxin10可能通过结合IRF-1而阻断其入核，最终抑制IRF-1的转录活性。综上所述，Ataxin10通过招募OGT对GAC进行O型糖基化修饰进而促进谷氨酸代谢和NSCLC的生长和迁移，同时，Ataxin10能结合IRF-1参与调控内皮细胞的激活，这将为NSCLC的防治提供新的药物靶点和理论依据。