bFGF二级肝素结合位点对其运动扩散和生物利用度的分子作用机制

The usage of fibroblast growth factor (FGF) as therapeutics for chronic disease is the fastest growing pharmaceutical area. However, FGFs act in a diffusible manner and are generally unstable in a tissue environment，which resulting in the current situation of high does and low lasting efficacy in clinical use. The prolonged retention is considered to maintain the activity of fibroblast growth factors in cells or in their environment, until the repair process is even completed. Our preliminary results showed that the movement of FGF is controlled by the cross-linking between its heparin binding sites (HBS) and heparan sulfate. Thus, this project is to engineer the HBSs that allows us to gain the control of the movement of FGFs over the natural mechanisms. This will characterize the function and key structures of secondary heparin binding sites of FGF2 in terms of controlling its diffusion and movement. The aim of this project is to extend the applications of FGF as therapeutics and establish further and comprehensive theoretical foundation.

用于慢性疾病临床治疗的成纤维细胞生长因子(FGF)是目前研发增长最快的医药板块。由于FGF自身在细胞基质中扩散/移动本质以及蛋白不稳定性质，导致了临床应用中大剂量给药和药效持久性低等现状。目前研究显示通过对FGF运动/扩散能力的控制，可以延长FGF在细胞外基质中的停留时间从而保持其生物活动，甚至直到修复过程的完成。我们前期工作发现FGF在细胞基质中的运动是通过其肝素结合位点(HBS)与硫酸乙酰肝素(HS)的交叉链接控制的。因此，本项目拟在前期工作的基础上，通过对FGF2的HBS2/HBS3进行修饰，在自然体制外对FGF移动进行控制，从而探讨二级HBS在FGF扩散/移动过程中的关键结构和功能特点。旨在增加生长因子治疗的应用形式，也为FGF2等生长因子类药物的研发奠定更为全面和深入的理论基础。

本项目的研究是通过对FGF蛋白稳定性，运动以及扩散能力的控制，从而延长FGF在细胞外基质中的停留时间以及保持其生物活性，对增强蛋白药物治疗的用药量和药效持久性提供理论基础。成功设计并合成了由丙氨酸取代FGF2蛋白二级肝素结合位点 (HBS) 上的赖氨酸和精氨酸的突变体基因序列（HBS2/HBS3）。通过利用已经搭建的HaloTag平台表达体系进行表达纯化，并成功获得重组目的蛋白。通过检测野生型和突变型FGF2蛋白稳定性和肝素多糖结构选择性，发现二级肝素结合位点突变对于FGF2蛋白结构的改变及其影响：FGF2突变体对于低硫酸化多糖的结合能力有着异于野生型FGF2的表现。FGF2 (HBS2) 对于氨基硫酸化的肝素多糖有着较高的结合能力。相对于野生型FGF2，两种FGF2突变体需要更大的多糖结构来实现最小的结合。这可能反映了FGF2对于多糖结构的重新结合能力受到肝素结合位点突变的影响。之前的研究显示，FGF2对于多糖结构的结合并不是持续的而是反复结合分离并迅速再次结合，而本课题的研究显示再次结合能力受到结合位点突变的影响，也因此印证了FGF2对多糖反复结合分离的现象。同时我们针对突变型FGF2对于人皮肤成纤维细胞中FGF信号通路的MAPK等关键信号分子表达水平的影响进行了相应检测，明确二级肝素结合位点突变对其生物活性的影响：FGF2刺激细胞生长所需的细胞内信号传导过程主要由HBS1来实现。同时在研究过程中发现带有二价锌离子或者铜离子的多糖结构对于生长因子的结合具有重大影响。而这一特点可能对于生长因子在体内分泌功能起到壁垒的作用。