小激活RNA上调抑癌基因VEZT在胃癌的作用及其分子机制

Gastric cancer is the primacy of gastrointestinal cancer with poor prognosis and high mortality. VEZT gene was identified a new tumor suppressor gene in gastric cancer in our previous study. Our results showed that the hypermethylation of VEZT promoter led to its low expression in gastric cancer in our previous study , VEZT inhibited gastric growth, invasion, migration and tumor formation in vitro and in vivo. saRNA can active the expression of VEZT in gastric cancer cells.However, the mechanism is not clear. Basing on these findings, we aim to employ RNAa technology to screen saRNAs which can activate VEZT expression in vitro. The effects of saRNAs on the proliferation, apoptosis and tumor formation of gastric cancer cells were examined after transfecting in vitro. Furthermore,the indexes of tumor volume and weight will be surveyed to evaluate the growth of human gastric cancer zenografts in nude mice with increased VEZT expression resulting from saRNAs activation. Consequently, the anti-tumor effect of VEZT can be determined in vivo. To reveal the molecular mechanism responsible for VEZT activation by saRNAs, we shall evaluate the status of methylation and histone modifications of VEZT promoter by dual-luciferase reporter gene assay, methylation-specific PCR, bisulfite sequencing PCR and CHIP-chip technology. In a word, this research is beneficial to gastric cancer therapy by investigating tumor suppressor gene activation using saRNAs and also provides evidence that VEZT would be explored as a target in gastric cancer treatment.

胃癌在消化道恶性肿瘤中位居首位，预后差、死亡率高。VEZT基因是我们前期研究中新发现的胃癌抑癌基因，其在胃癌中低表达与启动子区甲基化有关，体内外实验证明：VEZT抑制胃癌生长、侵袭、迁移和肿瘤形成，saRNA能激活VEZT表达。但其激活机制不明确。本研究拟以上述研究为基础，旨在运用RNAa技术筛选激活VEZT表达的saRNA，通过体外实验观察saRNA对胃癌细胞增殖、凋亡、成瘤性等的影响，体内实验观察激活VEZT表达后对裸鼠移植瘤的影响，评价其体内抗肿瘤效果。同时，为探讨VEZT激活的分子机制，我们运用荧光素酶报告基因、甲基化特异性PCR、亚硫酸盐测序PCR和CHIP-chip 技术分析saRNA激活胃癌VEZT表达与启动子区DNA甲基化、组蛋白修饰之间的关系。本研究旨在探讨saRNA介导VEZT激活用于胃癌治疗的可能性，为进一步研究VEZT作为胃癌治疗的新靶点提供理论依据。

胃癌在消化道恶性肿瘤中位居首位，预后差、死亡率高。确定一个能够有效的特异性上调VEZT表达的saRNA序列，确定saRNA对胃癌细胞生长、增殖、侵袭和迁移的影响。我们合成了三种作用于VEZT基因启动子不同位置的与转录起始位点相关的saRNAs。我们使用dsControl saRNA作为阴性对照；一种特殊的shRNA，用于敲去VEZT，并消除saRNA的任何非靶向效果。sgc-7901和m-28细胞均可与不同的saRNAs进行转染，或仅用lipofectamine2000单独处理。为了确定最有效的saRNA，实验中将使用实时PCR和蛋白质印记法检测每个组的VEZT基因 mRNA含量和相应蛋白质含量。在筛选后，两种细胞系都经过选择的saRNA,dsControl或Lipofectamine2000进行处理。saRNA处理的细胞分为两组:第一类被应用在实验中，第二组使用RNAi-mate转染shRNA。用cck-8试剂检测转染了saRNA、saRNA和shRNA以及其他细胞的增殖情况。用transwell小室试验测定细胞的入侵和迁移能力。我们通过实时PCR和蛋白质印记鉴定出最有效的saRNA。被选择的saRNA通过特异性的活化VEZT抑制GC细胞的生长、侵袭和迁移。实时PCR和蛋白质印记结果显示，与对照组相比(P<0.01)，saRNA处理组对VEZT表达有明显的上调作用，相应胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力明显下降;此外，对照组之间无明显差异(P>0.05)。这一现象为saRNA设计和胃癌基因治疗提供了理论依据。