宝山堇菜抗生物胁迫的转录组分析与CRP基因的鉴定

重金属超富集植物宝山堇菜具有很强的抗逆性，在研究该植物抗重金属分子机制时鉴定部分功能基因，编码多种半胱氨酸丰富多肽（cysteine-rich peptide, CRP），诸如大环寡肽(cyclotide)，涉及生物胁迫防卫。本项目将以对照、机械损伤、病原菌浸润和水扬酸处理的宝山堇菜为研究对象，构建Paired-end Index cDNA文库和Illumina测序，对获得的宏量ESTs进行功能聚类和表达丰度分析，在转录组水平探索宝山堇菜抗生物胁迫的分子机制以及不同类型CRP前体基因的表达模式；选择高表达或胁迫诱导型的新型大环寡肽、防卫素（defensin）和其它CRP前体基因，对其成熟多肽编码区应用内含肽技术进行重组表达和体外回收，分析不同类型的线性和环化CRP的抗生物胁迫相关生物活性。本项目有望整体揭示宝山堇菜抗生物胁迫的分子基础，为植物抗病虫育种和生物农药生产提供新的基因资源。

半胱氨酸丰富蛋白（CRPs）与植物的防卫功能和胁迫抗性密切相关。宝山堇菜是一种镉超富集植物，但是该植物中的CRPs资源以及基于CRPs的防卫机制在本项目执行前，尚未系统探究。本项目应用两种高通量测序技术（Roche 454FLX和Illumina Hiseq2000）测定了宝山堇菜的转录组。比较转录组、GO注释、KEGG注释结果显示，黄酮类物质及其前体苯丙烷的合成与代谢途径中的多个基因表达，响应胁迫处理条件，说明黄酮类物质的生物合成参与宝山堇菜抗逆性。本项目自主开发了不依赖于Blast的大环肽（Cyclotides）筛选工具CyExcel和CRPs筛选工具CrpExcel；应用上述工具在宝山堇菜转录组中9687 CRPs，主要包括锌指蛋白、脂转移蛋白、甜蛋白（thaumatins）、大环肽前体蛋白（cyclotide precursors）以及其它的植物防卫多肽前体蛋白。应用qRT-PCR分析了46个 CRP基因的表达模式，所有检测基因都显示不同程度的组成型表达，同时在镉添加和叶剪伤组中，植物防卫肽和蛋白相关CRP基因较锌脂蛋白基因更多显示上调表达，而后者更多显示下调表达。锌指类蛋白类CRPs及其基因的表达，可能代表了植物易受胁迫攻击的靶点。对CyExcel筛选的宝山堇菜转录组的新大环肽前体基因，通过ABI3730测序进行序列校对，结果在宝山堇菜中发现了31个大环肽前体蛋白基因和32个新环肽。此外，我们对宝山堇菜CRP的重组表达研究，成功融合表达了6个CRPs，包括金属硫蛋白、大环肽、褪皮素和防卫素。项目工作发表了4篇学术论文，其中2篇论文分别在国际植物学著名刊物《Planta》（SCI，2013年IF=3.376）和《Journal of Plant Physiology》（SCI，2013年IF=2.770）上发表。在人才培养方面，本项目培养研究生2名，本科毕业生15名。