一个新的小脑特异性高表达microRNA在神经干细胞定向分化及小脑发育中的作用

miRNA是小脑发育和神经干细胞定向分化中的重要调控分子。在前期工作中我们发现一条新的小脑特异性高表达的miRNA（miR-A）可调控神经干细胞的定向分化，可能起到类似开关的作用。本项目拟通过构建miR-A及其靶基因的过表达载体与干扰反义寡核苷酸片段，用免疫组化和流式细胞术等方法研究miR-A诱导神经干细胞向神经元定向分化的机制，为神经干细胞用于临床治疗提供新的线索。同时建立miR-A基因敲除鼠模型(Knock out mouse)，运用原位杂交技术、免疫组织化学、PCR及Western Blot等技术比较Knock Out鼠与正常鼠的小脑中miR-A及其靶基因的表达差异，以及神经元和神经胶质细胞比例的变化；并通过旷场行为实验，滚轴实验，共济失调检测实验等研究该基因敲除鼠的行为学改变，从整体水平研究miR-A对小脑结构和功能的影响，从而揭示miR-A在小脑生长发育过程中的作用。

目的：miR-A（miR-592）是本实验室从大鼠小脑中克隆得到的一条新microRNA，初步证实其与脑的发育相关。为了进一步研究miR-A（miR-592）的功能，我们选取大鼠神经干细胞（Neural Stem Cells，NSC）为研究对象，分析miR-A（miR-592）对大鼠神经干细胞分化的影响，筛选miR-A的靶基因，探讨miR-A（miR-592）调控大鼠神经干细胞分化的作用机制。.方法：（1）在体外原代培养大鼠神经干细胞，通过转染miR-A（miR-592）的表达载体和反义寡核苷酸片段，过表达和抑制NSC中的miR-A（miR-592），利用免疫细胞化学法和流式细胞术检测NSC的分化情况，分析miR-A（miR-592）对大鼠神经干细胞分化的影响；（2）结合生物信息学方法和双荧光素酶报告基因检测系统，筛选出与神经系统发育相关的miR-A（miR-592）的靶基因；（3）利用real time PCR及western blot检测转染后NSC中miR-A（miR-592）靶基因的表达水平，探讨miR-A（miR-592）调控大鼠神经干细胞分化的作用机制。.结果：（1）NSC中miR-A（miR-592）表达水平的变化会影响NSC的分化。与正常对照组相比，过表达miR-A（miR-592）后，星型胶质细胞数量明显减少，GFAP+/Tuj1+细胞比例减小；相反，利用2’-O-甲基修饰反义寡核苷酸抑制miR-A（miR-592）的表达后，神经元数量减少，星型胶质细胞数量增多，GFAP+/Tuj1+细胞比例明显增大；（2）结合生物信息学分析和文献查阅，筛选出与神经系统发育相关的miR-A（miR-592）的可能靶基因Enc1、Ina、Nfasc和Lrrc4c。通过双荧光素酶活性分析，证实Nfasc和Lrrc4c 为miR-A（miR-592）的两个靶基因，miR-A（miR-592）可直接作用于Lrrc4c和Nfasc的3’UTR区。（3）转染后NSC各组间miR-A（miR-592）靶基因Nfasc和Lrrc4c的mRNA水平没有显著差异，但蛋白水平有明显改变。过表达miR-A后，Nfasc和Lrrc4c的蛋白表达水平明显降低；相反干扰miR-A（miR-592）的表达后，Nfasc和Lrrc4c的蛋白表达水平明显升高。.结论：（1）miR-A（miR-