草鱼呼肠孤病毒逃逸宿主细胞RNAi作用通路的分子机制研究

草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是草鱼苗种培育阶段的主要病原之一。GCRV双链RNA(dsRNA)基因组逃逸宿主RNA干扰(RNAi)先天抗病毒作用通路的机制尚不清楚。申请者的前期研究发现GCRV的感染不抑制草鱼细胞中的RNAi基因沉默信号通路。本项目将进一步从GCRV基因组与宿主dsRNA受体蛋白Dicer、病毒编码的六种RNA结合蛋白(VP3、NS38、NS80、VP5、VP6和VP7)相互作用的角度探讨其免于被Dicer蛋白切割生成小干扰RNA(siRNA)的具体分子机理：(1)用体外转录和Northern杂交等方法研究宿主Dicer蛋白对人工合成dsRNA的结合与剪切活性在病毒感染前后是否一致；(2)用体外dsRNA结合和体内RNAi抑制等实验分析GCRV编码的dsRNA结合蛋白对病毒基因组是否具有保护性。本项目的研究结果将为利用RNAi技术控制病毒性草鱼出血病提供重要的理论基础。

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV）是引起草鱼出血病的病原，严重危害我国草鱼养殖业的健康发展。外源双链RNA是动物细胞RNA干扰信号通路的模式识别分子，但是GCRV复制过程中其双链RNA（dsRNA）基因组如何避免被宿主的RNA干扰（RNAi）通路清除掉仍不清楚。本项目以GCRV为模型试图解析双链RNA病毒如何避免激活宿主细胞先天抗病毒RNAi信号通路的激活。我们运用RNA转染和Northern blot 技术证实草鱼呼肠孤病毒的双链RNA基因组对草鱼细胞RNAi信号通路敏感，其基因组结构对dsRNA无保护性；运用siRNA和dsRNA介导的基因沉默实验证实草鱼呼肠孤病毒感染能抑制细胞内RNAi信号通路，说明病毒编码的蛋白质是影响RNAi信号通路的主因；构建了一个基于报道基因沉默效应的RNAi抑制蛋白筛选方法，发现病毒编码的双链RNA结合蛋白VP7在高表达的情况下具有RNAi抑制功能。在研究过程中，我们也揭示LITAF分子与草鱼呼肠孤病毒蛋白的相互作用，阐明LITAF介导的TNF信号通路介入了宿主抗病毒免疫；本研究制备了针对草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5和VP7的单克隆抗体和多克隆抗体，为本项目对GCRV病毒与宿主之间相互作用的研究提供了免疫学技术支撑，也可用于草鱼呼肠孤病毒临床的免疫学检测。利用这些抗体定量研究了不同株系的草鱼呼肠孤病毒与宿主的相互作用，证实病毒编码蛋白的差异引起了截然不同的细胞病变效应。