土壤杆菌M503低分子量β-1，3-葡聚糖生物絮凝剂合成相关基因的克隆及功能分析

生物絮凝剂是一种环境友好高效絮凝剂产品，合成效率低、成本高成为限制其推广使用的主要因素，从根本上解决这一问题需要明确生物絮凝剂的生物合成机制。本课题组在前期研究中，筛选得到高产絮凝剂菌株土壤杆菌 M503，经鉴定絮凝剂为分子量81000Da的β-1,3-葡聚糖，该絮凝剂水溶性好，絮凝效果显著，尤其是合成过程中糖转化率高于其它已知絮凝剂。本课题拟采用转座诱变技术，将转座子插入土壤杆菌M503基因组DNA，筛选获得β-1,3-葡聚糖合成缺陷型菌株，然后以插入的转座子DNA为已知信息采用反向PCR、锚定PCR等方法，结合同源基因保守序列分析，克隆低分子量β-1,3-葡聚糖生物絮凝剂合成相关基因，分析其序列特征，并利用互补实验验证缺失基因功能，为今后利用基因工程菌株生产低分子量β-1,3-葡聚糖生物絮凝剂奠定理论基础。

本项目克隆获得Agrobacterium sp. M503中β-1,3-葡聚糖（凝胶多糖）合成相关基因crdSAg、exoAAg及exoYAg，并利用在线生物信息学软件完成基因功能预测。其中crdSAg全长1965bp ，编码一个含654个氨基、分子量为73kD的蛋白CrdSAg。CrdSAg含一个与CESA-CelA同源、属于糖基转移酶2家族的保守区。CrdSAg是一个具有七个跨膜区的膜蛋白，蛋白二级结构包含43.12% α-螺旋, 17.89% β-折叠及 38.99% 无规则卷曲。CrdSAg与CrdS的同源性为99%，仅有13个氨基酸残基不同，差异极小。Agrobacterium sp.M503筛选自环氧丙烷皂化废水处理活性污泥，因此我们对环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组进行测序。通过对宏基因组序列分析，发现Agrobacterium sp.是组成活性污泥的主要菌种之一，并在宏基因组中发现与Agrobacterium sp.葡聚糖合成相关的基因序列。对这一序列进行Blast-p分析，发现其与Genbank上注释的Agrobacterium sp. C58的葡聚糖生物合成蛋白有36%的同源性。经保守区域分析，发现这一序列属Acyl_transf_3 家族。将这一序列和Agrobacterium sp. C58的CrdS进行序列比对，发现一些保守位点。对此序列进行跨膜区域分析发现，这一蛋白定位在细胞膜上，具有10个跨膜结构域，且未发现典型的信号肽序列，表明此蛋白可能具有其他特殊机制将其定位在细胞膜上，其葡聚糖催化合成机制有待深入研究。项目组筛选获得一株产凝胶多糖菌株Pseudomonas sp. QL212 (保藏编号：CGMCC NO.9651)。Pseudomonas sp. QL212只有在蔗糖作为碳源时发酵合成凝胶多糖，产量最高可达5.94g/L，高于现有已知Pseudomonas sp.合成凝胶多糖最高产量。经脱蛋白、离子交换层析及凝胶层析得凝胶多糖纯品，用多角度激光散射法测得其分子量为618 kD，水溶性较好，具有较高研究价值。对于所测试的高岭土、黄河水、印染污水及果汁等样品，QL212多糖发酵液絮凝率均达90%以上。基于本项目研究内容，发表研究论文7篇，其中SCI收录3篇、EI收录3篇，获中国商业联合会科技进步奖二等奖1项，申请国家发明专利3项。