Nogo-B通过调控Tregs影响ALI小鼠转归的作用及其机制研究

It has been proved that Nogo-B plays a protective role in the development and resolution of ALI/ARDS,while the specific mechanism is not clear. Until recently, it has been reported that Tregs play an importment part in the inhibition of pulmonary inflammation and resolution of injuryed ALI mice. Preliminary experiments found that, Nogo-B may be involved in the regulation of Tregs. This study aimed to clarify the key role of Nogo-B and its mechanism in the devevlpment of ALI. We apply WT,Nogo-B-/-,Rag-/-mice and CD4+ T cells，Tregs，AMs as objects, Using adenovirus to overexpress NogoB ,siRNA interference to knockdown Nogo-B expression, neutralizing antibody to deplete of T cells and specific T cell adoptive transfer techniques to observe the differentiation of CD4+T cells and Treg cell, infiltration of inflammatory cells,survival rate of mice and lung injury repair in the regulation of the expression of Nogo-B in ALI mice. Based on this, we further use cell culture techniques to explore the differentiation mechanisms of CD4+T cell in the regulation of Nogo-B n in vitro, aimed to clarify whether the protective role of Nogo-B in mice against ALI is achieved by regulating Tregs and its regulatory mechanisms and to provide new ideas for treatment of ALI/ARDS.

已有研究证实Nogo-B在ALI/ARDS的发生、发展及转归过程中发挥保护作用，但机制不清。新近发现，Tregs在平抑ALI小鼠肺部炎症及促进其损伤修复中扮演重要角色。为进一步阐明Nogo-B在ALI中的保护作用及其机制。本研究拟以WT、Nogo-B-/-和Rag-/-小鼠ALI模型以及CD4+T细胞、Tregs、AMs为主要研究对象，分别采用Nogo-B腺病毒转染高表达、siRNA干扰、特异性中和抗体以及T细胞过继转移等技术，观察调控Nogo-B表达对ALI小鼠CD4+T细胞分化、Tregs功能和肺内募集以及肺部炎症反应的影响，同时观察其与ALI小鼠存活率、后期肺组织损伤修复等之间的关系；此外，进一步采用体外细胞培养技术，探讨Nogo-B调控Tregs分化和功能以及肺内募集的机制，力求阐明Nogo-B对ALI/ARDS的保护作用调控Treg而实现的，以期为阐明临床救治提供新的思路。

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是临床表现为双肺弥漫性浸润、进行性下降的顽固性低氧血症的临床综合征。由于该病发病机制及病理生理过程不明, 临床缺乏药物及分子治疗手段。本课题组前期结果发现Nogo-B在ALI/ARDS的发生发展过程中发挥保护作用，但具体机制不清。近年来研究表明Treg细胞在ALI 小鼠肺部炎症及促进其损伤修复中有重要功能，为进一步阐明Nogo-B在ALI中的保护作用及其机制。本研究首先采用WT小鼠ALI 模型, 研究ALI 发生发展过程中Nogo-B表达与肺部Treg细胞数量的相关性; 并采用CRISPR/Cas9技术构建Nogo-B基因敲除小鼠ALI 模型, 进一步研究Nogo-B对ALI 小鼠模型肺部炎症损失修复程度及肺部Treg数量的影响; 其次, 采用腺病毒在体转染方法, 研究过表达Nogo-B 对ALI 小鼠肺部炎症及Treg细胞影响; 而后, 采用过继回输Treg方法研究Nogo-B保护性作用的针对性细胞; 最后采用体外培养Treg的方法研究Nogo-B对Treg细胞肺部募集的机制。结果表明，LPS气管腔内滴注诱导的ALI小鼠模型肺组织及肺泡灌洗液细胞中Nogo-B的表达呈动态变化, 其变化趋势与Treg细胞数量在炎症修复期的变化趋势一致，提示Nogo-B可能参与了ALI的病理生理过程，且Treg细胞表达Nogo-B；敲除Nogo-B基因后ALI模型小鼠炎症修复延迟、受损，肺部损伤程度加重，肺部Treg细胞数量下降，BAL和血清中IL-10浓度下降，表明了Nogo-B对ALI炎症修复期的保护作用，与Treg相关。过表达Nogo-B基因后ALI小鼠炎症修复能力增加，肺部损伤程度减轻，肺部Treg细胞数量增加，明确了升高ALI小鼠肺部Treg数量的作用。过继回输Nogo-B敲除的Treg细胞无法修复Rag-/-小鼠ALI模型的炎症，证实了Nogo-B在Treg细胞的肺部保护中有着重要作用。体外实验表明Nogo-B可促进Treg细胞的增殖和分泌IL-10的能力，阐明了Nogo-B通过Treg细胞保护ALI的作用机制。本研究证实了Nogo-B在小鼠ALI 模型炎症修复中的重要作用，并明确了Nogo-B对Treg细胞的增殖的作用，为临床救治ARDS 提供了新思路。