土壤杆菌胞外水溶性β-1,3-葡聚糖的生物合成机制研究

Salecan is a novel water-soluble microbial extracellular β-1,3-glucan. Salecan possesses a wide range of biological activities and has a promising application in food and medical fields. Clarifying of the biosynthetic mechanism of water-soluble β-glucan has fundamentally significance and will guide the structural modification and industrialized production of β-glucan. This project intends to reveal the mechanism of Salecan biosynthesis by genetic and molecular biology methods. First, the library of gene knockout and complementary mutants related to Salecan biosynthesis will be constructed by homologous recombination. The polysaccharide synthesis ability of mutants will be analyzed. The structure and molecular weight of polysaccharides produced by mutants will be also determined. The glycosyltransferases will be further obtained by heterologous expression and used to simulate polysaccharide repeating unit biosynthesis in vitro. Enzymatic synthesis of isotope-labeled glycosides will be performed by the permeabilized mutant cells. The labeled lipid-sugar intermediates will be separated and identified for glycosidic synthetic sequence analysis. Finally, the polymerization related proteins will be obtained by heterologous expression and used to simulate polymerization reactions of isotope-labled repeating units in vitro. The results will illustrate the biosynthetic mechanism of Agrobacterium extracellular water-soluble β-glucan, and contribute to the directional modification of Salecan industrial producing strain by metabolic engineering technology.

索拉胶（Salecan）是一种新型细菌胞外水溶性β-1,3-葡聚糖，因其多种生物学活性在食品和医药等领域极具应用前景。水溶性β-葡聚糖生物合成机制的阐明不仅有重要的基础意义，而且对这些多糖的结构改造以及工业化生产有指导作用。本项目拟对Salecan合成相关基因的功能和作用机制进行研究。将首先利用同源重组技术构建多糖合成相关基因敲除和回补突变株体库，分析突变株的产糖能力及所产胞外多糖的糖链结构和分子量的变化情况；进一步异源表达糖基转移酶，体外模拟Salecan重复单元合成过程；并利用突变株的透性化细胞进行同位素标记的糖苷合成反应，根据脂载中间体合成情况分析糖苷键合成顺序；最后，异源表达聚合相关蛋白，利用同位素标记的多糖重复单元，体外模拟糖链聚合过程。本研究将阐明土壤杆菌胞外水溶性β-葡聚糖Salecan的生物合成机制，并有助于我们通过代谢工程的手段实现对Salecan工业生产菌株的定向改造。

β-葡聚糖因其广泛的生物学活性而在食品和医疗等领域极具应用前景。β-葡聚糖生物合成机制的阐明有助于β-葡聚糖的高效制备和结构改造。索拉胶（Salecan）是一种新型微生物胞外水溶性β-葡聚糖,具有多种生物学活性。本项目采用遗传学和分子生物学手段研究了Salecan合成相关基因的功能，分析了多糖重复单元聚合和运输的机制，并探索了生物合成新型定长β-葡寡糖的新策略。首先，对Salecan合成基因簇进行了序列比对分析、转录分析和启动子活性测定以及糖基转移酶的拓扑结构分析，明确了基因簇中基因转录顺序和偶联性，以及糖基转移酶的细胞定位和作用；其次，利用同源重组技术和广谱质粒载体构建多糖合成相关基因敲除和回补突变株体库，测定突变株的产糖能力及所产胞外多糖或寡糖的糖链结构和分子量的变化情况，分析相应基因在多糖合成过程中的作用；然后，根据敲除菌株产糖情况推断多糖修饰酶在多糖重复单元合成过程中的作用，并对比分析修饰基团对多糖流变性质的影响；进一步的，检测基因簇中糖链聚合酶的跨膜域，测定聚合酶突变株的碳源利用和产糖情况，并利用代谢组学技术分析聚合酶突变株的代谢变化；最后，利用聚合酶突变株能够分泌胞外寡糖的特性，通过设计和优化发酵培养基实现生物合成新型定长葡寡糖的新途径。本项目研究通过研究土壤杆菌胞外水溶性β-1,3-葡聚糖Salecan的生物合成相关基因的功能和合成机制，为通过合成生物学和代谢工程手段实现Salecan工业生产菌株的定向改造以及Salecan及其衍生物的合成提供数据支持和理论依据。