基于T7系统与原核宿主正交的转录元件构建及应用

Synthetic gene circuits are rapidly becoming core components in synthetic biology and biotechnology. However, it was embarrassed by the consistency, effectiveness and regulable ability of synthetic gene circuits, of which the transcriptional element played a critical role. In the present project, the strategy of regulation of T7 expression system with small RNAs was applied to construct an orthogonal transcriptional element to achieve the consistency, effectiveness and regulable ability. The present studies include the determination of the lethal dosage of T7 RNAP in E. coli（DE3）strains, feasible examination of T7 gene circuits with gfp report gene in different model bacterium (E. coli, B. subtilis, P. putida, L. lactis ) and industrial application of protein soluble expression and metabolic network reconstruction with T7 gene circuits. The project and its results are invaluable for the theory research and industrial application of metabolic engineering and synthetic biology.

构建基因线路模块是现代分子生物学技术和合成生物研究中发展最迅速的领域，但是基因线路模块的通用性、高效性和可调节性是面临的重要问题，构建各种基因线路模块的关键是其中的转录元件要具有通用性。本课题拟利用反义RNA调控噬菌体T7表达系统的方法，构建与宿主菌正交的转录元件，用以解决基因线路的通用性、高效性和可调节性问题。研究首先测定大肠杆菌DE3溶源菌中T7 RNAP的非致死表达量；然后利用报告基因(gfp)构建具有通用性、高效性和可调节性的与宿主正交的正交转录元件，研究其在模式工业菌株(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、乳酸菌)中的调控规律；最后将该正交转录元件应用于重要工业酶的高活性表达和工业菌的代谢网络构建研究。本研究能为基因线路模块的研究，以及野生菌的基因工程改造提供重要的理论数据和有效工具，具有重要的理论意义和应用价值。

T7表达系统是应用最广泛的原核表达系统之一，具有超强的转录能力。但该系统高度依赖 DE3 溶源菌，通用性和可调节性有限。本研究基于反义RNA技术，结合分子生物学、流式细胞仪、细胞生物学等研究方法，对T7正交转录元件的构建和应用进行了深入系统的研究。首先，通过建立基于ELISA法检测T7 RNAP的方法，测定各种DE3溶源菌表达T7 RNAP的能力，确定了正常启动T7启动子的T7 RNAP量的上限值。其次，经过反义RNA序列的理性设计，成功构建了单质粒T7自表达系统，并半定量测定了不同反义RNA与表达T7RNAP的关系。通过对表达T7RNAP基因转录启动子的优化，采用降低启动子活性、优化核糖体结合位点（RBS）结构等手段调节T7RNAP的表达量，构建了稳定性好，表达量可调节，可以在多种原核生物宿主中应用的T7正交转录元件，其性能与现有在DE3溶源菌中应用的T7表达系统的表达能力相当。第三，将T7正交转录元件应用于中华根瘤菌体系，表达用于生产D-对羟基苯甘氨酸的双酶D-海因酶和N氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶，综合酶活达到了现有生产菌的水平。本研究成功构建的T7正交转录元件，实现了稳定性好，通用性强和表达蛋白量可调节目标，为T7表达系统在非模式菌中的应用提供了一种简便的方案，具有很好的科学意义和应用潜力。