花生几丁质酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因启动子的克隆与功能分析

几丁质酶(Chitinase, Chi)及β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase, Glu)是植物抵御真菌性病害的两个关键酶，受到病原真菌及信号分子的诱导表达，其上游启动子序列大多含有为病原菌及激发子识别的调控元件。本研究拟在花生中克隆几丁质酶基因(Ah-Chi)和β-1,3-葡聚糖酶基因(Ah-Glu)的启动子序列，并通过PCR法克隆得到系列启动子缺失序列。构建含有不同启动子序列及GUS基因的融合表达载体，通过遗传转化洋葱表皮细胞以及花生来验证不同启动子序列的诱导启动功能，以期找到两启动子序列中特异的对病原菌及激发子应答的顺式作用元件，并确定驱动活性最强的启动子序列。为在花生中通过调控实现内源Ah-Chi和Ah-Glu基因安全、高效、特异的表达提供理论基础；同时为在花生遗传转化过程中特异诱导表达启动子的有效利用提供理论依据。

植物几丁质酶(Chitinase, Chi)及β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase, Glu)是植物抵御真菌性病害的两个关键酶，容易受到病原真菌及激发子的诱导而积累。用1.5mmol/L水杨酸(Salicylic Acid，SA)对花生幼苗进行诱导处理，提取RNA利用 Real-time PCR技术检测几丁质酶基因(Ah-Chi)及β-1,3-葡聚糖酶基因(Ah-Glu)的表达量。结果表明经诱导后Ah-Chi及Ah-Glu的表达量均有所增加，并于某时间点达到最高值，分别是未经SA诱导的2.47和1.8倍。利用TAIL-PCR技术扩增得到Ah-Chi及Ah-Glu上游启动子序列，长度分别为1710bp及973bp，命名为Ah-Chi-P和Ah-Glu-P。PLACE 和 PlantCARE 启动子在线预测分析表明，Ah-Chi-P和Ah-Glu-P序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件，还含有病原菌及SA响应的顺式调控元件。根据预测的功能元件序列设计引物，利用PCR法扩增得到Ah-Chi-P和Ah-Glu-P的5' 端系列缺失片段，并构建相应的植物表达载体 pCAMBIA1301-Ah-Chi-P~pCAMBIA1301-Ah-Chi-P5 以及pCAMBIA1301-Ah-Glu-P~pCAMBIA1301-Ah-Glu-P4。通过农杆菌介导法将各表达载体转化洋葱表皮细胞，进行GUS组织化学染色。结果表明：经SA诱导后，Ah-Chi-P和Ah-Glu-P及各个缺失片段均能够驱动GUS基因的表达，GUS染色显示蓝色，未经SA诱导的洋葱表皮细胞GUS染色未显示蓝色，说明两启动子均属于诱导型启动子。转基因洋葱表皮细胞GUS酶活性检测结果以及转基因花生GUS基因Real-time PCR 检测结果表明，Ah-Chi-P和Ah-Glu-P不同的缺失片段驱动活性有所区别，启动子活性与启动子片段长度并没有直接的相关性，表明两启动子内部可能同时存在正、负调控元件。结合PLACE和plantCARE数据库预测结果，初步断定TGACG，GRWAAW以及W-box属于受SA诱导的正调控元件，而GT1-motif，TGTCA可能属于负调控元件。