紧密连接在肺爆震伤Ⅰ型肺泡上皮细胞通透性调节中的作用研究

肺爆震伤在临床上多见，常很快进入急性肺损伤阶段，死亡率高达30%。肺上皮通透性增加是肺爆震伤发病的中心环节，调节肺上皮通透性就成了防治的重要策略。近期我们应用高压气体作用于Ⅰ型肺泡上皮细胞，发现紧密连接（TJ）功能降低。TJ具有离子选择性，其功能的变化，可以改变细胞对钙离子的通透，后者则是肌球蛋白轻链激酶调节上皮细胞连接间隙的关键因子。能否通过TJ影响胞内钙离子，进而调节肺上皮通透性，防治肺爆震伤目前还不清楚。本项目首先应用肺爆震伤动物模型，研究TJ对肺上皮通透性的调节，并探讨TJ调节肺上皮通透性的机制；再培养Ⅰ型肺泡上皮细胞，应用TJ通道蛋白阻断剂、Rho-GTPase特异性siRNA等方法，研究Rho/ROCK通路对TJ的活化机制及TJ对胞内钙离子浓度的影响。以期完善肺上皮通透性调节机制，揭示肺爆震伤发病新机制，为寻找肺爆震伤防治的新药物靶点提供依据。

本项目首先建立肺爆震伤动物模型，观察发生肺爆震伤后肺组织病例改变，肺泡上皮细胞通透性改变和TJ结构的改变情况，研究爆震伤后肺泡上皮细胞Claudin1、Claudin3、Claudin 4的表达水平与肺泡上皮细胞的通透性的相关关系；再培养Ⅰ型肺泡上皮细胞，应用TJ 通道蛋白阻断剂、ROCK 通路阻断剂等方法，研究紧密连接功能对大鼠肺泡上皮通透性的影响和机制；最后培养肺泡上皮细胞，筛选效率最高的特异性siRNA，分别干扰Claudind1、Claudind3和Claudind 4蛋白，检测细胞Claudin1、Claudind3和Claudind 4蛋白的表达和通透性改变，研究紧密连接蛋白Claudin1、Claudin3、Claudin4在大鼠肺泡上皮TJ构成中的作用。结果发现：肺爆震伤后肺泡上皮细胞Claudin3、Claudin 4的表达水平与肺泡上皮细胞的通透性有关，二者呈负相关关系。说明单层细胞通透性增加，与ROCK通路有关；也与Ca/CaM介导的肌球蛋白轻链激酶磷酸化途径关系不大；单层细胞通透性增加是细胞旁通透性的增加，不必一定有细胞形态的改变。在导致单层细胞通透性增加的TJ功能变化中，Claudind3和Claudind4起到了比较关键的作用。研究结果有助于探讨肺爆震伤发生时肺泡上皮细胞通透性升高的可能的产生机制和作用机制，初步揭示产生肺泡上皮细胞通透性与Claudind 蛋白表达、TJ功能变化之间的因果关系，从而加深对肺泡性肺水肿过程的理解，以期完善肺泡上皮通透性调节机制，为寻找肺爆震伤防治的新药物靶点提供依据。