晚发型婴儿痉挛共患自闭症候选易感/致病基因CD99L2人群验证及致病机制的研究

Late-onset infantile spasms (LOIS) had severe symptoms, worst prognosis,poor response to ACTH, and its cognitive impairment was significantly more severe than classic infantile spasms, most commonly comorbid autism. Recent studies showed that genetics might be the most important cause. Our team previous study about IS with unknown cause via whole exon sequencing (WES) indicates that CD99L2 gene may be novel pathogenic candidate genes for LOIS-A. This study plans to screen the mutations of these CD99L2 gene among LOIS-A patients to ascertain the incidence of different mutations. Meanwhile, we are also going to employ the technologies of CRISPR/Cas9 targeted gene editing, hippocampal slices ex vivo culture, patch clamp to explore the possible influences of these mutations on synaptic function, neuronal excitability and epileptiform discharges. Thus, we will study the pathogenic role of these genes in LOIS-A from in vivo, cellular to molecular level. The outcome of this study will not only confirm CD99L2 as the novel pathogenic genes for LOIS-A for the fist time, but also enrich our recognition of the pathogenesis of LOIS-A, eventually providing new evidence for therapy , improveing prognosis and genetic counseling.

晚发型婴儿痉挛症状重，对促皮质素效果差，其认知损害的严重程度明显重于经典婴儿痉挛，最常共患自闭症。最近的研究显示遗传因素可能是最重要的病因。基于申请者团队前期对不明原因婴儿痉挛患者家系全外显子测序的结果分析，结合现有的研究基础，认为CD99L2基因是晚发型婴儿痉挛共患自闭症的易感/致病基因。本研究拟在此类患者中进行CD99L2基因候选变异筛查，明确基因变异在晚发型婴儿痉挛共患自闭症患者中的发生率。同时采用CRISPR/Cas9靶向基因编辑、离体脑片培养、膜片钳等技术，从在体到细胞至分子水平进行研究，探讨基因候选变异对突触功能、神经元兴奋性以及痫样放电的影响。其研究结果不仅可首次证实CD99L2基因为晚发型婴儿痉挛共患自闭症新的易感/致病基因，也将极大丰富我们对晚发型婴儿痉挛共患自闭症发病机制再认识，为治疗提供新思路，改善预后，为遗传咨询、优生优育提供理论理论依据。

晚发型婴儿痉挛症状重，对促皮质素效果差，其认知损害的严重程度明显重于经典婴儿痉挛，最常共患孤独症谱系障碍。最近的研究显示遗传因素可能是晚发型婴儿痉挛最重要的病因。随着二代测序技术在临床的广泛应用，研究发现CD99L2基因与癫痫、孤独症谱系障碍、脑性瘫痪等神经系统疾病密切相关，但具体机制仍不清楚，该基因功能至今未明确。那么，探讨CD99L2基因是否在晚发型婴儿痉挛发病机制中是否发挥作用、怎样发挥作用，将为晚发型婴儿痉挛发病机制的研究提供一个新视角，为治疗提供新思路，改善预后，为遗传咨询、优生优育提供理论依据。.本研究分为3部分：①通过细胞免疫荧光、EdU细胞增殖实验、流式细胞术等技术发现在人神经母细胞瘤SY5Y细胞中，CD99L2基因突变使神经细胞增殖增强，凋亡减少，而CD99L2蛋白定位无明显改变。②利用Western blot和RT-PCR等技术在HEK293T细胞（人胚胎肾细胞293）中，从分子蛋白水平上发现CD99L2基因突变增加CD99L2蛋白表达，并激活ERK/c-FOS信号通路。③利用免疫共沉淀技术（co-inmunoprecipitation，CoIP）、平行反应监视（parallel reaction monitoring，PRM）相对定量蛋白质组学、蛋白互作网络(protein protein interaction network，PPI)等技术发现CD99L2突变SY5Y细胞和野生型SY5Y细胞存在195个显著差异蛋白，并证实CD99L2蛋白与引起神经发育障碍（主要表现为X连锁智力障碍，可伴有癫痫发作、孤独症谱系障碍等）的DDX3基因所编码的DDX3蛋白之间存在相互作用。.本研究首次明确了CD99L2基因突变对神经细胞增殖的影响，对ERK/c-FOS信号通路的调控；进一步发现CD99L2蛋白与引起神经发育障碍相关的DDX3蛋白之间存在相互作用。从一个全新的角度探讨了CD99L2基因的作用机制，有助于进一步阐明晚发型婴儿痉挛合并孤独症谱系障碍的发病机制。