14-3-3蛋白调控天然橡胶生物合成的分子机制

14-3-3 proteins are a family of highly conserved proteins which can be found in all eukaryotic organisms. They regulate activities of a wide array of target proteins via protein–protein interactions which involves binding with phosphoserine/phosphothreonine residues in the target proteins. They have beeninvolved in regulation metabolic, growth and developmental, hormone signaling pathways and response to stress. Different 14-3-3 isoforms expressed in plant cells have isoform-specific roles of 14-3-3 proteins. Laticifers in the bark of the rubber tree is a specialized secretory tissues, in which natural rubber is formed and stored. The molecular mechanism underlying natural rubber biosynthesis and regulation remain largely unknown. Our preliminary evidence is proposed that the 14-3-3 protein in the laticifers may participate in regulation of rubber biosynthesis. This study is aimed to identify the molecular mechanism of 14-3-3 protein regulation of key genes participating in natural rubber biosynthesis via HbRZF, as well as to underlying the regulation relationship between 14-3-3 protein and the regulatory enzymes in natural rubber biosynthesis. These researches will enhance our understanding of the molecular mechanisms of 14-3-3 protein regulation of natural rubber biosynthesis, and also put us in a competitive position in developing new stimulants for natural rubber production through biotechnology.

14-3-3蛋白是真核生物中一类重要的调节蛋白，不同的同工型具有不同的细胞特异性，特异地调控靶蛋白来参与代谢的调控。乳管是橡胶树中特化的分泌组织，是天然橡胶合成的场所。前期研究表明乳管中Hb14-3-3a与锌指蛋白转录因子HbRZF相互作用，Hb14-3-3b与小橡胶粒子蛋白相互作用。推测乳管中的14-3-3蛋白一方面与天然橡胶的生物合成途径中的关键酶结合调控酶的活性，另一方面与转录因子的互作来调控天然橡胶生物合成关键酶基因的表达，在转录水平参与天然橡胶生物合成的调控，但具体调节的分子机制还不清楚。本项目拟在前期研究基础上采用分子生物学和生物化学相结合的研究手段，分析HbRZF介导的14-3-3蛋白调控橡胶合成关键酶基因的分子机制和14-3-3蛋白与橡胶合成关键酶的互作对橡胶生物合成的影响，阐明14-3-3蛋白调控橡胶生物合成的分子机制，为通过生物技术调控天然橡胶的生物合成提供理论基础。

橡胶树是天然橡胶（顺式1,4-聚异戊二烯）的重要商业来源。在巴西橡胶树中，橡胶转移酶负责将异戊烯基二磷酸按顺式-1,4聚合，从而影响橡胶的产量。目前对橡胶转移酶基因在分子水平上的调节机制知之甚少。而14-3-3蛋白是真核生物中一类重要的调节蛋白，不同的同工型具有不同的细胞特异性，特异地调控靶蛋白来参与代谢的调控。我们采用酵母双杂交、BiFC和Pull-Down等方法，证实了14-3-3蛋白（HbGF14a）与HbRZF存在蛋白之间的相互作用。进一步证实了HbGF14a与HbRZF的相互作用发生在HbGF14a的7-8螺旋；HbRZF与HbGF14a互作发生在HbRZF的C端的RKVTCP 结构域。酵母单杂交证实，HbRZF与橡胶合成关键酶-橡胶转移酶的启动子（pHbHRT）存在蛋白质-DNA的结合。双荧光素酶瞬时表达体系实验结果表明HbRZF负调控pHbHRT，而HbGF14a解除HbRZF 对pHbHRT的负调控。同时，我们还采用酵母双杂交、BiFC和Pull-Down证实HbGF14c与HbSRPP存在蛋白质间的相互作用。这些结果有助于我们进一步认识天然橡胶的生物合成，为采用分子生物学手段改良高产橡胶树品种提供理论基础。