IS204转座酶介导的微型转座系统的催化机理及其在合成生物学中的应用

A valuable mini-transposon mutagenesis system encoding a special transposase Tnp within its inverted repeat (IR) was constructed on the basis of an insertion sequence IS204 from Norcardia asteroids YP21. Interestingly, the IS204 transposase Tnp could only be able to cleave at an inverted repeat junction rather than the separated pair of inverted repeats when the system was introduced into Streptomyces coelicolor M145. In order to explain this phenomenon and further declare the catalytic mechanism of Tnp, a series of in vitro experiments between purified Tnp and transposition donors, which contained different type and combination of IRs, were designed to test on three major aspects including biding ability, cleavage situation and transposition efficiency. The results would be further tested in vivo. Meanwhile, the mini-transposon mutagenesis system would be improved and revalued according to these outcomes. And a brand new secondary transposition gene deletion system would be created based on the new mini-transposon mutagenesis system, which would provide a novel and convenient method to produce random gene reduction and investigate gene function for synthetic minimal cell.

本实验室在IS204的基础上构建了适用于天蓝色链霉菌M145的微型转座系统。该系统转座效率高，稳定性好，使用方便，极具开发与使用前景。值得关注的是，与常用转座酶不同，该系统转座酶Tnp在M145体内只能作用于相邻的一对反向重复序列，而不能识别间隔开的两个反向重复序列。为了解释这一现象，我们将表达纯化Tnp，通过设计一系列实验，解析Tnp催化转座发生的基本过程，并从转座酶与底物的结合力度、切割情况以及整个转座反应效率这三个方面，评估不同底物对转座反应的影响，从而揭示转座酶Tnp的基本作用机理，以便进一步对该系统进行优化。在此基础上，我们还将设计并构建可进行无痕基因缺失的"二次转座系统"。与传统上转座因子介导产生基因缺失的方案相比，利用"二次转座"进行基因缺失操作简单，耗时短。这项工作将为建立染色体随机缺失文库，探究基因功能，乃至构建最小基因组提供全新的实验思路与技术手段。

来源于Norcardia asteroids YP21 IS因子IS204的微型转座子已被证实可高效的应用于Streptomyces coelicolor，本项目中，我们将该系统扩展应用于Amycolatopsis mediterranei U32，通过筛选，我们获得9株利福霉素生物合成突变株，其中我们重点研究了一个LuxR基因家族的转录调控子(RifZ)。通过同源重组构建，我们获得rifZ基因突变株及遗传回补株，利福霉素生物合成基因簇（rif）相关基因转录显著降低。通过DNase I footprinting保护实验，我们证明RifZ能结合rif基因簇6个启动子中的5个区域，具有保守的RifZ box (CTACC-N8-GGATG)，为rif基因簇的途径特异性转录因子。同时，我们基于该类转座子的特性发明了一种两次转座构建基因组随机缺失的系统。在S. coelicolor M145中，我们筛选到了105株染色体随机缺失的突变株，其中多株发生较大的基因组缺失，通过高压脉冲电泳（PFGE）和比较基因组杂交(CGH)，我们证实了这类大片段缺失的发生。该微型转座子可广泛应用于包括稀有放线菌的多种放线菌中，将在放线菌功能基因簇探测和最小基因组构建中具有重要的应用价值。