慢病毒Gag蛋白的SUMO化修饰对病毒复制的影响

慢病毒的Gag蛋白与基因组RNA共同构成病毒颗粒的核心。Gag蛋白在合成后沿微管运至细胞膜附近，微管运输被阻断后Gag将在细胞核周围聚集，HIV Gag的SUMO化修饰亦得到证实。本课题以HIV和EIAV为材料，首次将Gag的SUMO化修饰与Gag的核周聚集和RNA包装相联系，以SUMO化修饰对病毒复制和RNA包装的影响为目标，通过①确认Gag蛋白的SUMO化修饰位点、②改变细胞内SUMO化状态、③检测Gag蛋白核周聚集和病毒RNA包装的变化，结合Gag蛋白的聚集、Gag-RNA相互作用和病毒载量等指标，验证如下模型：慢病毒Gag蛋白利用宿主的SUMO化修饰系统实现自身极化，在细胞核附近形成局部高浓度，有利于与病毒RNA的结合。本课题将阐明Gag蛋白SUMO化修饰的生物学意义和Gag核周聚集的分子机理，探索改变SUMO化水平干扰慢病毒复制的可能性，寻找控制慢病毒感染的新靶点。

Gag蛋白是包括慢病毒在内的反转录病毒的重要结构成分，在病毒生活周期的早期和晚期都发挥重要作用。Gag由基质蛋白(MA)、衣壳蛋白(CA)、核衣壳蛋白(NC)和C端的p9组成。SUMO化修饰（SUMOylation）是近年发现的翻译后修饰，经一系列酶促反应，将小类泛素化修饰肽（small ubiquitin-like modifier，SUMO）共价连接到靶蛋白上，并由此改变其定位、稳定性及与其它蛋白的相互作用。本项目以马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus, EIAV)为材料，对Gag的SUMO化修饰进行了研究。首先制备了抗Gag、MA、CA、NC和p9的多克隆抗体。然后利用大肠杆菌表达/修饰系统，证实了Gag的SUMO化修饰，发现存在多个修饰位点。接着利用体外SUMO化修饰系统检测到NC可以被修饰，但修饰主要发生在C端的p9上，且存在多个修饰位点。利用定点突变将p9的6个赖氨酸逐一突变为电荷不变的精氨酸，除K30突变体外，其它点突变的p9均能利用多个位点进行修饰，说明p9中存在多个修饰位点，而K30是主要位点之一。用亲和层析对融合有6×组氨酸标签的重组p9进行了纯化，切取SDS-PAGE中推测发生了SUMO化修饰的p9条带进行质谱分析，在三次重复中，除鉴定到p9片段（覆盖率74.7％）和SUMO片段（覆盖率28.9％）外，还鉴定到2个K5发生SUMO化修饰的分支片段，证实了p9 的SUMO化修饰，且K5是主要位点之一。此外利用缺失互补的方法证明了Ubc9及其C93在p9 SUMO化修饰中的作用。最后，将融合有EGFP标签的Gag真核表达质粒转染入293T细胞，利用激光共聚焦显微镜观测了Gag的亚细胞定位，研究了SUMO、Ubc9及泛素（ubiquitin）对Gag定位的影响：Gag主要定位于细胞质，但在细胞质中又不是弥散分布的，而是聚集成大小不等的斑块。共转染SUMO、Ubc9或泛素的真核表达质粒则EGFP-Gag的荧光强度、聚集成的斑块数量、直径及直径的差异程度均有所变化。本项目首次证实了EIAV的Gag能被SUMO化修饰，鉴定了发生修饰的主要Gag组分及赖氨酸残基，研究了SUMO化修饰对Gag在真核细胞中定位的影响。上述结果初步揭示了宿主的翻译后修饰与病毒蛋白之间的关系，为开发慢病毒治疗的药物和疫苗提供了新靶点。