基于高通量多层次的胆管癌测序数据进行癌症免疫治疗的新抗原筛选及评估

Cancer immunotherapy is a hot field of cancer treatment, in which a successful screening of tumor antigen targets is crucial for implementation of cancer immunotherapy. However, due to the particularity of tumor immunotherapy targets, an appropriate bioinformatics screening method is still insufficient, the subsequent experimental validation work is time-consuming, and it will be hard to meet the needs of clinical research. In preliminary studies, we have established a systematic and standardized dendritic cell (DC) induced cytotoxic T lymphocytes (CTL) clinical application system for tumor cell immunotherapy. Moreover, we also have established a high-throughput sequencing technology platform to assist immunotherapy exploration. This project intended to study cholangiocarcinoma to explore bioinformatics methods for screening candidate tumor-specific antigens via integrating datasets from The Cancer Genome Atlas (TCGA) , The Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) and our laboratory sample resources, performing combinational algorithm to decrease false positive results caused by heterogeneity of tumor mutations, comprehensively analyzing tumor information on multi-levels including mutation, copy number and expression, predicting epitopes in Immune Epitope Database (IEDB) and verifying immune response and cell cytotoxicity by experiments. Through this project, it is expected to provide a more systematic understanding and useful reference information for a bioinformatics platform construction and individualized treatment, and to realize its application value in tumor immunotherapy in the future.

肿瘤免疫治疗是癌症治疗领域的热点，其中肿瘤抗原靶点的成功挖掘是实施癌症免疫治疗的关键。但由于肿瘤免疫治疗靶点的特殊性，目前尚缺乏合适的生物信息学分析筛选方法，使得后续验证工作费时耗力，难以满足临床需求。在前期研究中，我们已建立树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞的肿瘤免疫治疗临床体系，同时，我们已建立起高通量测序平台，以期辅佐免疫治疗研究。本项目拟以胆管癌为研究对象，探寻适合肿瘤特异性抗原靶点的生物信息学筛选方法，通过整合癌症和肿瘤基因图谱、癌症细胞系百科全书数据库及本实验室的样本资源，运用组合算法减少肿瘤突变异质性造成的假阳性结果，综合分析多层次（突变-拷贝数-表达）的癌症数据信息，采用免疫表位数据库预测抗原表位，并进行免疫反应及杀伤实验验证。本项目为后续生物信息学平台的搭建及个性化治疗提供了更为全面系统的认识和有用的参考信息，有望将来在肿瘤免疫治疗中实现其应用价值。

胆管癌恶性程度高，其发病机制复杂、预后差、死亡率高。近年来，肿瘤免疫治疗在癌症临床治疗中备受关注。生物信息学是筛选肿瘤免疫治疗抗原靶点的强有力工具，但不同实验室分析结果差异大，重复性低，后续验证费时耗力。本研究首先整合文本挖掘和多组学数据挖掘结果，对胆管癌相关文献与多层次水平（突变、拷贝数、表达和甲基化）的分子变异进行了筛选，构建了胆管癌数据库，进一步筛选出免疫相关基因，并在此基础上分别比较了预测基因的表达与肿瘤免疫浸润细胞比例和启动子区甲基化水平的相关性。应用IEDB数据库进行T细胞表位预测，进一步评估验证预测基因在胆管癌免疫治疗中的价值。. 研究发现，胆管癌相关文献共4646篇，包含1837个基因，其中1023个基因在不同组学水平上发生了分子变异。免疫功能富集与层次聚类发现七个基因在肝胆恶性肿瘤中存在特异的表达模式。其中，APCS的表达与B细胞浸润比例呈负相关；FGA、MBL2、APCS与LBP的表达与CD8+T细胞浸润比例呈负相关；APOA1与MBL2的表达水平与巨噬细胞浸润比例呈负相关。此外，APCS、LBP和APOA1基因的表达还与其甲基化水平呈负相关。单基因的ROC分析与多基因组合的模型性能评估均显示，7个基因均有较好的鉴别效果（AUC>0.7），独立验证数据集中也具有较高的预测准确度。实验验证结果显示，胆管癌中LBP、FGA、MBL2、APOA1、C9与APCS在RNA水平显著低表达（P值均小于0.05），其中C9在蛋白水平蛋也为低表达，而APOA1和LBP则在其启动子区域检测到了高甲基化。此外，研究筛选出肿瘤相关抗原（TP53，hTERT和Survivin）进行抗原负载等实验，流式检测DC细胞成熟能力较好，其表面标记阳性率均达到85%以上。同时，DC细胞抗原递呈和激活T细胞免疫应答的能力较好。. 本项目运用文本挖掘与生物信息学方法，筛选胆管癌免疫相关基因及抗原靶点，构建了肿瘤相关知识库，为实现胆管癌精准医疗提供了更为全面系统的认识和有用的参考信息，并为将来拓展至其它癌症的相关研究奠定了理论基础。