重度智力障碍并癫痫候选易感/致病基因ATP2A2、RYR1和RYR2分析验证及发病机制的研究

Severe intellectual disability with epilepsy (SID-E) is one subtype of intellectual disability with the most severe manifestation and worst prognosis. Recent studies showed that genetics might be the most important cause. Our previous study about SID-E with unknown cause via whole exon sequencing (WES) indicates that there genes (ATP2A2，RYR1 and RYR2) which are involved in calcium homeostasis may be novel pathogenic candidate genes for SID-E. This study plans to screen the mutations of these three genes among SID-E patients to ascertain the incidence of different mutations. Meanwhile, we’re also going to employ the technologies of CRISPR/Cas9 targeted gene editing, hippocampal slices ex vivo culture, patch clamp, and confocal microscopy Ca2+ imaging to explore the possible influences of these mutations on synaptic plasticity, neuronal excitability and epileptiform discharges. Thus, we will study the pathogenic role of these genes in SID-E from in vivo, cellular to molecular level. The outcome of this study will not only confirm ATP2A2，RYR1 and RYR2 as the novel pathogenic genes for SID-E for the fist time, but also enrich our recognition of the pathogenesis of SID-E, eventually providing new evidence for therapy and genetic counseling。

重度智力障碍并癫痫（SID-E）是儿童智力障碍患者症状最重、预后最差的表型之一。最近的研究显示遗传因素可能是最重要的病因。基于申请者前期对不明原因SID-E患者Trios全外显子测序的结果分析，结合现有的研究基础，认为钙稳态相关基因ATP2A2、RYR1和RYR2可能是SID-E新的候选易感/致病基因。本研究拟在此类患者中进行上述3个基因候选变异筛查，明确基因变异在SID-E患者中的发生率。同时采用CRISPR/Cas9靶向基因编辑、离体脑片培养、膜片钳和激光共聚焦钙成像等技术，从在体到细胞至分子水平进行研究，探讨基因候选变异对突触可塑性、神经元兴奋性以及痫样放电的影响。其研究结果不仅可首次证实上述3个基因为SID-E新的易感/致病基因，也将极大丰富我们对SID-E发病机制的再认识，为其治疗提供新的思路，为遗传咨询、优生优育提供理论依据。

重度智力障碍合并癫痫（SID-E）是儿童智力障碍中预后最差的表型之一，遗传因素是主要病因之一。本中心在前期工作中对不明原因SID-E患者进行全外显子测序（WES）在4个SID-E家系中发现了3个内质网钙稳态相关基因ATP2A2，RYR1，RYR2突变，通过相关软件预测为有害变异，猜测这3个基因是SID-E的易感/致病基因。推测ATP2A2突变可能影响其编码的内质网Ca2+-ATP酶2（SERCA2）对Ca2+的转运效率，RYR1、RYR2突变可能影响RyR与神经元特异性调控因子结合，破坏细胞内钙稳态，进而影响下游通路，改变神经元兴奋性及LTP的形成，最终导致SID-E。.本研究扩大SID-E的WES样本量至100个，发现了ATP2A2其他3个变异，以及其他Ca2+稳态相关基因如CACNA1A等变异。体外细胞实验发现ATP2A2错义突变加剧内质网钙耗竭和线粒体钙超载，增加了低浓度谷氨酸诱导的内质网应激和线粒体介导的凋亡；SERCA2激动剂CDN1163可以逆转ATP2A2突变导致的SERCA2b活性下降引起的钙耗竭和内质网应激。细胞实验证实CACNA1A突变导致线粒体功能紊乱，部分突变（G701R、R279C、D1644N）进而导致自噬、凋亡。利用CRISP-Cas9技术成功构建2个RYR2点突变（E1083G、P2259L）小鼠模型，虽然两种杂合及纯和模型小鼠在生长发育、行为学、心功能、脑电监测、脑组织形态方面和野生小鼠表现无差异。但通过匹罗卡品诱发癫痫模型发现P2259L纯合小鼠（PL/PL）较野生小鼠出现抽搐的潜伏时长短、惊厥持续状态持续时间长、抽搐发作更严重。膜片钳结果发现PL/PL神经元诱发后的后超极化电位（AHP）明显增加，且证实在兴奋负荷下PL/PL神经元内质网RyR2通道更容易发生Ca2+泄漏，RyR2/calstabin2复合体稳定剂S107能稳定RyR2通道的关闭状态，减少内质网钙离子泄露，降低PL/PL小鼠的癫痫诱发敏感性。.本研究通过全外显子测序发现多个SID-E家系中存在ATP2A2，RYR2，CACNA1A等基因突变，进一步为这些基因是SID-E的致病基因提供了证据，同时通过体内外功能实验对这些基因的功能进行了初步探索，研究SID-E的可能发病机制，丰富了钙稳态在神经系统疾病发病机制中的认知，为智力障碍和癫痫的诊疗提供了新的思路。