建立生长与生产偶联的正反馈筛选体系

The introduction of heterologous products biosynthesis pathways in artificial cells may break the original dynamic balance of the host, which could cause the contradictory of host growth and production. It is an effective way to improve the production of heterologous products by coupling the production with growth and then regulating modules during adaptive evolution. The applicant plans to design and construct a gene switch which can respond to the concentration of target compounds, and control the growth of microorganisms, namely the positive feedback coupling of growth and production. In this study, we will focus on the artificial yeast which can synthesize 7-dehydrocholesterol (7-DHC) as a proof of concept. We will start from the receptors that bind to 7-DHC analogs and try to obtain a specific 7-DHC receptor by protein directed evolution method, and further design the gene switch to control the transcription level of genes that affect host’s growth, such as genes relevant to nutrition supplement, oxidation pressure resistance and antibiotics resistance, and finally realize the coupling of growth and 7-DHC production. Hopefully, we can get the yeast strain with both high productivity of 7-DHC and high growth rate by adaption the strain itself to the environment. This study demonstrates the method to couple the production of target compounds and cell growth to from a selection system to enrich positive mutation, and supplies new view and techniques for improving other heterologous pathways expression in artificial cells.

人工细胞合成异源产物往往会打破宿主细胞内部原始的动态平衡，造成异源产物表达与底盘菌株生长之间的矛盾。若能找到偶联生长与生产的方法，再通过适应性进化，就可以使宿主自我调配各个模块，达到增强异源产物合成的目的。申请者拟设计构建响应产物的基因开关，通过感受细胞内产物的浓度来调控菌株的生长，以期形成生长与生产的正反馈偶联。本研究将以人工酵母合成7-脱氢胆固醇（7-DHC）为例，从7-DHC结构类似物的受体出发，通过蛋白定向进化获得特异结合7-DHC的受体，进而构建响应7-DHC的基因开关，来调控可抵御选择压力的相关基因（例如抗生素抗性）的转录，实现菌体生长与7-DHC生产的正反馈偶联。最终通过筛选压力，迫使菌体为加速生长，而提高7-DHC的产量。本研究通过建立生长与生产之间的正反馈偶联，构成在进化群体中逐步富集正向突变的筛选体系，为在人工细胞中增强其他异源产物的表达提供了新的研究思路和技术手段。

甾体激素在机体生理过程起调节作用，在激素相关疾病研究方面，癌症预防和治疗需要开发癌症预测模型和工具，这些模型和工具的准确性依赖于大量的基因序列信息，而目前的从病人基因组测序获取突变信息的方法存在耗时耗力、样本不全面等缺陷；在激素类药物中间体的生产方面，植物提取成本高、来源不稳定、污染环境，化学合成和微生物催化成本高。本文利用酵母作为平台，开展甾体激素受体蛋白基因突变和异源合成激素类药物中间体及优化策略的研究。针对人类功能蛋白的基因突变，在酿酒酵母中建立了人类雄激素受体突变的检测和表征平台。利用酵母双杂交体系，通过个报告基因的表达，将雄激素受体配体结合域的突变对不同激素类分子刺激下的响应信号转化为酵母的生长速率，从而实现简便、快速、高通量的检验。并且用建立的酵母平台对雄激素受体的突变进行模拟，筛选潜在的癌症相关突变。在蛋白水平对配体结合域与激素类分子结合后形成的复合体进行分析，探索不同突变产生表型差异的原因。针对甾体类药物中间体的生产，以酿酒酵母或耶氏解脂酵母作为细胞工厂，构建7-DHC、菜油甾醇、孕烯醇酮、21-脱氧皮质醇等甾体激素类药物中间体的合成路径。并采取底盘选择、异源基因模块来源优化、异源基因模块多组分试配、发酵碳源优化、酶定向进化等策略，提高人工细胞工厂中目标化合物的合成水平。7-DHC、菜油甾醇、21-脱氧皮质醇的产量均达到克升水平。上述目标产品均获得微生物中已知最高产量。本项目不仅在酿酒酵母中建立了一个高效、通用的人类功能基因突变的研究平台，为临床和病理研究提供数据资源；而且构建了多株生产甾体激素类药物中间体的酵母菌株，为甾体激素类药物的合成提供清洁绿色高效的生产方式。