橡胶树HbEIN3-1调控天然橡胶生物合成的分子机制

Ethylene, as a stimulant of latex production in Hevea brasiliensis, has been widely used in commercial latex production, which greatly improved the production of natural rubber. However, molecular mechanisms of ethylene stimulation of latex production to increase production of natural rubber in the rubber tree remained unknown. Previous studies have reported that ethylene stimulation is due to prolonged the latex flow time and may not have a direct effect on the biosynthesis of natural rubber. The rubber tree cis-isopentyltransferase (HbCPT) is the last step rate enzyme for natural rubber biosynthesis. Our preliminary evidence showed HbEIN3-1 bound to the promoter of the cis-prenyltransferase gene, suggesting that HbEIN3-1 may be involved in the regulation of natural rubber biosynthesis, but the mechanism of ethylene action is not completely elucidated, especially in molecular aspect. In this study, we intended to employ a combination of biochemistry and molecular biology to study HbEIN3-1 regulating the cis-prenyltransferase gene and the study of HbEIN3-1 integrated ethylene and jasmonic acid signaling pathway to regulate the biosynthesis of natural rubber. The results will be elucidate the molecular mechanisms of HbEIN3-1 in the regulation of natural rubber biosynthesis and clarify the role of ethylene in the regulation of natural rubber biosynthesis.

乙烯已广泛应用于橡胶树刺激采胶，大幅度提高了天然橡胶产量。但乙烯刺激增加天然橡胶产量的作用机制还不明确。先前研究报道乙烯刺激是延长了橡胶树的排胶时间而对天然橡胶的生物合成调控可能没有直接作用。而我们在前期研究中证实了乙烯信号途径关键转录因子HbEIN3-1与天然橡胶生物合成的关键限速酶—顺式异戊烯转移酶（HbCPT）基因的启动子结合，并确定了HbEIN3-1与HbCPT结合的部位，说明HbEIN3-1可能在转录水平参与HbCPT表达的调控，表明乙烯信号途径可能直接参与天然橡胶生物合成的调节，但具体的调控机制还不清楚。本项目将在此基础上，采用生物化学和分子生物学相结合的研究手段，开展HbEIN3-1调控HbCPT表达的分子机制和HbEIN3-1整合乙烯与茉莉酸信号途径协同调控天然橡胶生物合成的研究，阐明HbEIN3-1调控天然橡胶生物合成的分子机制，明确乙烯在调控天然橡胶生物合成中的作用。

世界98%以上的天然橡胶都来自橡胶树。天然橡胶生物合成能力是决定天然橡胶产量的一个关键因素。本项目开展HbEIN3-1调控天然橡胶生物合成的关键酶HbCPT基因表达的分子机制和HbEIN3-1整合乙烯信号与茉莉酸信号途径协同调控天然橡胶生物合成机制的研究，阐明了HbEIN3-1调控天然橡胶生物合成的分子机制，明确了乙烯在调控天然橡胶生物合成的作用，为研制高效、低伤害的新型刺激剂提供理论依据。.主要研究结果有：1.证实了 HbEIN3-1与HbCPT的互作及调控关系。本研究酵母单杂交证明HbEIN3-1 与HbCPT的启动子之间的存在相互作用，并用凝胶阻滞实验进一步证明。用双荧光素酶系统研究证明 HbEIN3-1增加了HbCPT的活性。在胶乳体外基因表达体系中发现了转录因子HbEIN3-1调控橡胶转移酶HbCPT的活性。2.证实了HbEIN3-1与 HbMYC2、HbJAZ3、HbHDA6蛋白之间存在互作关系。根据HbJAZs、HbHDA6和HbMYC2 基因序列克隆基因。按照酵母双杂交方法，将构建好的阳性质粒共转化酵母菌Y2HGold 菌株。结果显示HbEIN3-1与MYC2、JAZ3、JAZ11和HDA6有互作关系。利用双分子荧光实验进一步证实了HbEIN3-1与HbMYC2、HbJAZ3、HbHDA6有相互作用关系。3.橡胶树转基因功能验证VIGS系统的建立。根据橡胶树HbPDS基因序列，预测编码基因中的siRNAs，选取了大小为409bp的一段序列进行克隆。用含pTRV2-HbPDS重组质粒GV3101农杆菌细胞对橡胶树幼苗的叶片受体进行侵染。在侵染2个月后，新叶逐渐出现叶片漂白现象。通过qRT-PCR检测了阴性对照和转基因植株不同部位叶片中HbPDS基因的相对表达量，发现转基因植株基因表达量比对照低，说明VIGS系统可用于鉴定橡胶树基因的功能。4.转基因验证HbEIN3-1对HbCPT 基因表达的调控。根据橡胶树HbEIN3-1的序列信息选取一段序列。按照VIGS系统建立的方法进行。通过qRT-PCR检测了阴性对照和转基因植株胶乳中HbEIN3-1和HbCPT基因的相对表达量，发现转基因植株HbEIN3-1和HbCPT基因表达量比对照低，说明HbEIN3-1对HbCPT基因表达的具有调控作用。