茉莉酸应答转录因子HbWRKY1对天然橡胶生物合成调控的分子机制

天然橡胶生物合成的调控是天然橡胶生产中面临的一个重大理论问题，目前国内外对天然橡胶生物合成的研究主要集中在对合成途径中相关酶的特性、基因的同源克隆及表达等方面，而天然橡胶生物合成调节的分子机制还不清楚。本项目申请者在国家自然科学基金项目( 批准号：30760203）的资助下开展了天然橡胶生物合成调控的相关研究，获得了一个在橡胶树乳管中特异表达的WRKY转录因子（HbWRKY1），并且HbWRKY1基因受茉莉酸诱导表达。已有研究表明茉莉酸应答转录因子参与次生代谢调控，而橡胶树乳管中的天然橡胶的生物合成受茉莉酸调节，但具体的调节机制还不清楚。因此本项目拟进一步开展茉莉酸应答转录因子HbWRKY1对天然橡胶生物合成调控的研究，一方面可以阐明HbWRKY1调控天然橡胶生物合成的分子机制，另一方面为利用生物技术调控天然橡胶的生物合成，提高天然橡胶的产量提供理论依据。

天然橡胶是巴西橡胶树中的一种重要的次生代谢产物，其基本化学单元是顺1,4-聚异戊二烯，在橡胶树中以胶乳的形式贮存。目前国内外对天然橡胶生物合成的研究主要集中在对合成途径中关键酶的分离纯化、基因的同源克隆及表达、酶特性分析等方面，而对天然橡胶生物合成调控的分子机制研究较少。本研究获得了调控天然橡胶生物合成的关键因子小橡胶粒子蛋白SRPP的转录因子HbWRKY1，并对其进行了功能特性研究，旨在更深入的揭示天然橡胶生物合成调控的分子机制。. 本研究克隆了HbSRPP启动子，该序列含有多个典型的真核生物启动子基本元件，且具有光响应、激素、组织特异性、非生物胁迫等应答元件。通过酵母单杂交在巴西橡胶树胶乳中分离到了调控HbSRPP的转录因子HbWRKY1。HbWRKY1由479个氨基酸残基组成，与其他植物WRKY类蛋白有高度同源性。HbWRKY1具有2个WRKY家族特有的结构域和C2H2锌指结构。HbWRKY1在胚状体中表达量较高，花、树皮、胶乳、叶片表达量较低。亚细胞定位分析结果表明HbWRKY1定位在细胞核内。共表达pSRPP/HbWRKY1转基因烟草GUS表达活性明显受到抑制，暗示了HbWRKY1对HbSRPP具有负调控作用，可能是天然橡胶生物合成途径中的负调控因子。根据HbWRKY1的序列，分离了HbWRKY1的5′调控序列854 bp。HbWRKY1的5′调控区的核心启动子区域位于-6~ -57 bp，转录起始位点位于翻译起始位点上游41 bp处。该序列具有启动子核心序列TATA-box等典型的真核生物启动子基本元件。通过了酵母单杂交技术筛选了橡胶树乳管中调控HbWRKY1的3个转录因子HbRGZF1、HbERF和HbMYC2，序列分析得出HbRGZF1的ORF为522 bp，编码了173个氨基酸，分子量为19.24KD，理论等电点为6.33；HbERF1的ORF为594 bp，编码了197个氨基酸，分子量为22.47KD；HbMYC2的ORF为1986 bp,编码了681个氨基酸，分子量为74.61KD，理论等电点为5.69。通过酵母双杂交技术筛选了橡胶树乳管中7个与HbWRKY1相作的蛋白，它们涉及植物生长、发育、物质代谢和信号转导。其中有一个与参与胶乳代谢相关的蛋白。