金鱼Tgf2转座酶的结构域鉴定及其转座机制研究

DNA transposons can apply effective DNA transposition within their host genomes, which exhibit great potentials in target gene trapping and functional interpretation of important traits in fish species, considering strategy of insertional mutagenesis mediated by transposon. The present study will be carried out cencerning 3 different transposases encoded by our previously discovered Tgf2 transposon from Goldfish, which is a novel, autonomous ones belonging to hAT superfamily in vertebrates. The assays of DNA excission in vitro and excission-integration in vivo in zebrafish towards donor plasmids are to be used for evaluating activities of Tgf2 transposases with different deletions in N-terminus. Furthermore, the essential domains in active transposase, such as DNA binding and catalytic domains, are to be bioinformatically predicted, PCR seperated and prokaryotically expressed as single domain polypeptides. The corresponding polypeptides will be functionally identified by DNAase footprint, gel-filtration chromatography, and DNA excission assay in vitro. Therefore, key domain architecture of Tgf2 transposase is probably to be clarified, including possible mechanism in transposition. Our study aims to make clear domain organization in Tgf2 transposase, hopefully favorable for further molecular reconstruction and acquirement of superior transposase. It will lay the foundation for establishment of insertional mutagenesis library for target genes encoding for main traits in farmed fish species.

DNA转座子(Transposon)可在基因组中进行高效转座，基于转座子的插入诱变策略，在鱼类重要性状主控基因的筛选、功能解释方面具有重要的研究前景。本项目拟在近年我们发现的一个新的、具有自主转座活性的脊椎动物hAT超家族转座子，即金鱼Tgf2转座子基础上，从其编码的3种不同区域缺失的转座酶入手，进行转座酶介导Tgf2转座子供体质粒的体外DNA剪切活性和斑马鱼体内切离-整合活性研究，确定金鱼Tgf2转座酶的活性形式；以生物信息学方法预测出转座酶DNA结合区、催化区等必需结构域，进行特定基因结构域区域分离，并原核表达获得独立结构域多肽；通过DNAase足迹法、分子筛层析谱图、体外DNA切离酶活测定等方法，鉴定出转座酶关键结构域的功能及排布，探索其可能作用机制。本研究旨在阐明金鱼Tgf2转座酶的关键结构域组成，以期改造、并获得更优的转座酶，为养殖鱼类重要性状主控基因插入诱变库的建立奠定基础。

DNA转座子的转座遵循“切离-粘贴”机制，即在其编码的转座酶催化下，从原始位置切离并插入到新的基因组位置。DNA转座子逐渐成为用于基因插入诱变研究的重要遗传学工具及转基因及基因治疗的DNA转运工具。然而，目前从各种生物内发现的几乎所有转座子在漫长的进化中、因宿主的纵向钝化而突变失去活性，即非自主性转座子。本课题组在我国金鱼体内发现了Tgf2转座子，是继青鳉Tol2 转座子之后、第二例具有天然活性的脊椎动物转座子，对其结构和功能深入研究，旨在了解Tgf2转座子的作用机制，为高效转座系统的开发奠定基础。.同源建模和氨基酸序列比对显示，全长Tgf2转座酶（N端到C端）可划分为BED锌指、二聚化、RNaseH（含DDE催化核心和核定位信号）等结构域。从金鱼胚胎分离得到的7种不同长度的Tgf2转座子mRNA转录本出发，获得其编码的3种野生型转座酶：即全长转座酶（673aa）、N端锌指结构域不同缺失的转座酶（578aa和564aa）。.采用原核表达体系，构建转座酶的表达质粒-Rosetta 1(DE3)-pET28a-Tgf2；摸索并建立了该系统的Tgf2转座酶表达条件。原核系统表达的Tgf2转座酶分别以L-Tgf2TP、S1-Tgf2TP、S2-Tgf2TP命名；采用FPLC平台的亲和层析法纯化得到了电泳纯的目的蛋白，经MALDI-TOF-MS/MS鉴定正确。.使用葡聚糖层析的方法研究Tgf2转座酶的体外DNA结合能力，结果显示：较S-Tgf2TP，L-Tgf2TP表现出了显著的对探针DNA（含部分末端反向重复和亚末端重复序列）结合活性；质粒消化实验用来研究3种Tgf2转座酶的体外DNA切割能力，结果显示：S-Tgf2TP和L-Tgf2TP都呈现对供体质粒（含左右臂序列）的切割活性；通过显微注射转座酶蛋白和供体质粒，斑马鱼胚胎发育早期荧光率和成熟期的足迹分析显示：3种Tgf2转座酶都具有体内转座活性，从胚胎发育早期荧光率来看 L-Tgf2TP较S-Tgf2TP表现出了更显著的转座活性。足迹分析显示：L-Tgf2TP介导的转座在插入位点保留了hAT家族转座子特征性的、完整8bp重复序列，而S-Tgf2TP介导的转座在插入位点仅残留不完整8bp重复序列。研究显示：N端锌指结构的缺失可能关系到Tgf2转座酶对供体序列的结合及靶位点整合插入的效率和准确性。