基于单细胞成像研究钌配合物作为识别肿瘤细胞的荧光探针和对凋亡信号通路的影响

药物对细胞凋亡信号通路的影响，较难进行单细胞成像和分析，不能追踪细胞内药物的分布、转运和代谢。利用荧光探针实时准确识别肿瘤细胞和活体检测在肿瘤的诊断、治疗、药物的研究等方面具有重要意义。本项目利用分子内电荷转移（ICT）荧光团为信号团，设计合成发射波长在近红外区的Ru（Ⅱ）小分子荧光探针，基于荧光增强或淬灭原理，构建能够识别肿瘤细胞的荧光探针，利用激光共聚焦显微镜和活体细胞成像工作站，实现"亚细胞定位"和单细胞水平的"可视化"和"实时动态"观测，完整的检测Ru 对细胞膜受体识别、在细胞质、细胞核中的位置以及转运全过程；结合MALDI-TOF MS 开展凋亡相关的动态亚细胞蛋白质组学研究，阐明探针在细胞中引起的差异蛋白点；Western Blot 等方法检测探针对信号通路中特定基因、蛋白的识别及调控的生物学效应；进一步研究该探针对活体肿瘤的识别和荧光成像能力；探明其作为肿瘤诊断试剂的可能性。

肿瘤诊断试剂的开发一直是研究的热点也是难点课题。应用小分子荧光探针进行肿瘤细胞的识别和活体肿瘤成像，对于癌症的检测、诊断、治疗具有极其重要意义。. 本课题提出了二个新的设想：①利用配合物的荧光性能进行单细胞成像，研究钌配合物在肿瘤细胞中的亚细胞定位和动态过程；②设计能够特异性识别肿瘤细胞的配合物，既可以增加其对肿瘤细胞的选择性抑制作用，同时还可以用于肿瘤识别诊断试剂。经过近5年的研究探索，证明该设想切实可行，并且有可能发展成活体肿瘤诊断试剂。. 基于上述学术思想，本课题开展了以下研究：.（1） 实现钌配合物在细胞内的荧光成像：本项目设计的荧光探针是利用了ICT荧光基团，设计合成发射波长在600-720nm 的荧光探针，利用激光共聚焦扫描显微镜和活体细胞成像工作站，建立肿瘤细胞内钌配合物的实时监测与成像技术，发现钌配合物对肝癌、肺癌（A375、HepG2、HeLa、A549）等肿瘤细胞具有识别和荧光成像功能，而在正常细胞（HL-7702，人正常肝细胞）中荧光微弱或没有荧光。（2）分析了探针的构效关系，初步阐明其识别肿瘤细胞和荧光成像的机理。研究表明钌配合物的亚细胞定位与其结构、水溶性和脂溶性密切相关，脂溶性较好的钌配合物进入细胞所需时间较短，并且可以到达细胞核的位置，水溶性较好的钌配合物到达细胞核所需时间较长并且只能到达细胞质的位置，这些为我们进一步开发肿瘤识别与诊断试剂提供了重要的基础。（3）研究了手性异构体钌配合物在肿瘤细胞中的亚定位功能，发现钌配合物对细胞的识别也具有手性选择性，揭示了进入细胞核的钌配合物抗肿瘤活性可能与细胞核中的DNA有关。钌配合物进入肿瘤细胞中可以与DNA相互作用，荧光显著增强，荧光增强的原因在于DNA保护了配合物，使之不受水分子的进攻，因此通过探针在肿瘤细胞中的荧光成像可以识别肿瘤细胞。 （4）该探针具有特异性识别肿瘤细胞和抗肿瘤活性的双重功能，尤其是在研究其抗肿瘤活性过程中，利用其荧光成像特性，实现实时观测药物对细胞或组织的影响，尤其是可以观察到对肿瘤细胞凋亡过程。这些研究结果为双重功能抗肿瘤药物及肿瘤诊断试剂的钌配合物奠定了基础。