复苏植物牛耳草DnaJ蛋白参与水分胁迫下叶绿体保护的作用机理

Water stress causes damages of chloroplast ultrastructure, degradation of chlorophyll, decrease of the activities of photosystems and photosynthetic enzymes and reactive oxygen species accumulation, leading to the inhibition of plant growth and production. In contrast, a dicot resurrection plant Boea hygrometrica can tolerate water loss up to 90% of RWC, maintain the integrity of chloroplast structure and pigment-protein complexes, and fully recover in a few hours after rehydration. The protective mechanism is not clear yet. DnaJ proteins have been known as heat shock protein-type of chaperons that contribute to stress protection. Previously, a dehydration-induced gene encoding a chloroplast-targeted DnaJ protein, designated BhDnaJ6, had been cloned in B. hygrometrica. The overexpression of BhDnaJ6 in Arabidopsis leads to improved drought tolerance and stablized electron transfer efficiency via a mechanism that may differ from the traditional DnaJ proteins. Here we propose to use yeast two hybrid, pull-down and BiFC techniques to screen proteins which interact with BhDnaJ6 in chloroplast, determine the key regions of BhDnaJ6 for protein interaction, and use transgenic plants to investigate the mechanisms of BhDnaJ6 and its protein interaction in protecting chloroplasts under severe drought stress. The results will reveal the role and new mechanisms of DnaJ proteins in chloroplast protection under drought stress.

水分匮缺引起的超微结构破坏、色素降解、光系统和酶活降低及活性氧积累等叶绿体伤害是作物在干旱下生长受抑并最终造成减产的主要原因。研究发现复苏植物牛耳草可在失水90%以上时仍保持叶绿体结构完整，色素蛋白复合体不解聚，并在遇水几小时后恢复正常功能，但其机制未知。DnaJ蛋白在逆境保护方面有重要作用。本项目前期克隆了一个干旱诱导的牛耳草热激蛋白基因BhDnaJ6，在拟南芥中过表达可显著提高植物抗旱性，其作用机制可能与光合电子传递相关，与以往报道的DnaJ蛋白不同。本项目将利用酵母双杂交，pull-down和BiFC等技术鉴定与BhDnaJ6互作的叶绿体蛋白，确定其互作关键功能域，阐明其蛋白互作对植物抗旱性和叶绿体结构及功能的影响。研究结果不仅可揭示DnaJ蛋白在保护复苏植物叶绿体结构与功能中的作用机制，而且将为解释植物抗旱机制提供新理论和新基因资源。

复苏植物牛耳草在脱水过程中叶绿体结构仍保持完整，叶绿素含量基本不变，类囊体色素蛋白复合体保持结构稳定，表明牛耳草中存在某种特殊的叶绿体保护机制，可确保其结构稳定、大分子复合体不解聚。众多研究表明定位于叶绿体的DnaJ6蛋白对于叶绿体的发育和逆境保护都具有重要作用。本项目就课题组前期牛耳草转录组数据发现的定位于叶绿体的DnaJ蛋白展开研究，并获得以下主要研究结果：. 1.分析了牛耳草热激蛋白基因BhDnaJ6在干旱、35℃热激以及外源ABA处理时的表达变化，结果表明BhDnaJ6基因均受干旱、热激及ABA的诱导，但是干旱和ABA诱导表达比较强烈。. 2.对软件预测定位于叶绿体的BhDnaJ6构建了亚细胞定位载体，利用小烟草瞬时转化法和拟南芥稳定表达法来验证实际定位情况，证实BhDnaJ6蛋白定位于叶绿体中。. 3.克隆BhDnaJ6基因并转化拟南芥，得到纯合的BhDnaJ6过表达株系。BhDnaJ6过表达赋予转基因拟南芥较强的抗旱能力，说明BhDnaJ6可能参与植物的抗旱反应。利用Dual-PAM-100对过表达拟南芥在干旱胁迫条件下叶绿素荧光参数进行测定，结果表明，BhDnaJ6过表达拟南芥株系在干旱胁迫下能够保持较好的光合活性，表现出较强的光保护能力，且光合电子传递相对稳定，推测BhDnaJ6蛋白可能参与了干旱条件下叶绿体光系统和电子传递链的保护。. 4.酵母双杂交技术筛选到三个与BhDnaJ6互作的且定位于叶绿体的互作蛋白(BhJ6INP9，BhJ6INP33，BhJ6INP55)，并且利用双分子荧光互补技术进一步验证了BhDnaJ6与上述三个蛋白在植物体内能够发生互作。推测BhDnaJ6可能保护上述三个蛋白从而参与干旱条件下植物叶绿体光系统和电子传递链的保护。. 5.通过对过表达拟南芥及牛耳草中中BhDnaJ6与其三个互作蛋白转录水平和蛋白水平表达情况分析，可以看出BhDnaJ6对三个互作蛋白在蛋白水平上有一定的保护作用。说明BhDnaJ6蛋白通过保护电子传递链上的蛋白或光系统复合物上的蛋白来保护牛耳草叶绿体结构稳定，使其能在遇水时迅速恢复生命活动。. 本研究首次揭示DnaJ蛋白对复苏植物光合电子传递起保护作用，将有助于进一步阐明牛耳草响应干旱胁迫时叶绿体结构保持稳定和可复苏的机制。