黄原胶生物降解途径的解析及重建

Xantho-oligosaccharide produced by xanthan degradation has special physiological activities, such as anti-oxidant and the defense responce. Therefore, xantho-oligosaccharide is a valuable functional oligosaccharide. However, at present, the xanthan degradation is not controllable that lead to mixed oligosaccharides with different degree of polymerization and side-chain structure. Thus it is difficult to study the structure-activity relationship. It is important to reveal and reconstruct the pathway of xanthan degradation. In this project, we are going to heterelogously express the xanthan-degrading cluster in the type strain Bacillus subtilis and reveal the function of the cluster. Meanwhile, we will increase the degrading specificity of xanthan backbone by fusing endoxanthanase with carbohydrate binding modules to produce oligosaccharides with low dispersity. Finally, the xanthan-degrading cluster will be reconstructed and expressed in B. subtilis based on “gene networks”, resulting in a recombinant strain that could specifically degrade xanthan and produce xantho-oligosaccharides with uniform structure. Our work will elucidate the molecular mechanism of xanthan degradation and is significant for the production of functional oligosaccharides at food grade.

黄原胶降解产生的低聚糖不仅有抗氧化活性，而且有较强的诱抗活性，是一种有价值的功能性寡糖。然而，现阶段微生物降解黄原胶的可控性差，获得的寡糖产物为聚合度分散、侧链结构不单一的混合物，不利于后续构效分析和工业化生产。因此，解析黄原胶生物降解途径并进行理性改造是亟待解决的问题。本项目拟在枯草芽孢杆菌模式菌株中异源表达微细菌Microbacterium sp. XT11的黄原胶降解基因簇，并阐明相关基因元件的功能。同时，通过黄原胶内切酶与糖结合单元的融合，提高酶切割黄原胶主链的特异性，降低寡糖产物分散度。最后，基于“基因电路”思想，利用上述研究获得的功能基因元件，实施黄原胶降解基因簇的功能改造，构建能够可控降解黄原胶的枯草芽孢杆菌工程菌，获得分散度低、侧链结构单一的寡糖并进行初步构效分析。本项目将进一步阐明黄原胶降解的分子基础，获得的新信息和新材料将对研制食品级功能寡糖具有重要理论意义和经济价值。

黄原胶寡糖具有良好的生理活性，是一种有潜在应用价值的功能糖。现阶段酶法降解黄原胶制备寡糖的可控性差，造成寡糖产物聚合度分散、侧链结构不单一，不利于研究和应用。因此，解析黄原胶生物降解途径并进行理性改造是亟待解决的问题。本项目成功从微细菌Microbacterium sp. XT11中克隆获得17kb黄原胶降解基因簇，并利用差异转录/翻译分析和酶学性质表征等手段预测并完整验证了黄原胶的生物降解途径，即黄原胶内切酶能够随机切割高度有序的黄原胶主链并产生寡糖，ABC糖转运蛋白能够识别并结合黄原胶寡糖将其转运至胞内，随后被β-葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶继续水解代谢。本工作还重点研究了黄原胶裂解酶C端的糖结合单元CBM，发现其具有高度特异性识别结合黄原胶侧链的特性，将其融合至不同来源纤维素酶可导致重组酶水解黄原胶酶活显著提高，最高可达野生型酶酶活的2倍以上。更有意义的是，裂解酶CBM的融合导致重组酶切割黄原胶主链的方式发生了明显改变，由原本的随机切割转变为规律性精准切割，使得黄原胶水解产物由聚合度分散的中高分子量寡糖混合物变为聚合度相对集中（DP5-15）的低分子量寡糖产物。利用基因电路思想理性改造了黄原胶降解基因簇，包括将内切酶、裂解酶、β-葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶和ABC转运蛋白的启动子全部替换为诱导型启动子，将各个元件N端添加高效分泌信号肽段，同时将分子改造的黄原胶内切酶整合至基因簇中，构建了B. subtilis 工程菌株WB-oligoXAN，其降解黄原胶产生的寡糖分子量大约在900-2700 Da，聚合度较为分散，具有良好的自由基清除活性和抗氧化性。本研究所取得的进展为复杂多糖生物降解机理的阐明打下了基础，并为支链寡糖的精准化制备提供了理论支持和技术保障。