E3泛素连接酶Smurf1介导的对Runx2 表达调控在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中的作用

牙髓干细胞具有多向分化的能力，被认为是一种可用于组织工程修复多组织联合缺损的种子细胞，但有关牙髓干细胞分化的机制尚不清楚，而对如何定向诱导牙髓干细胞分化更是知之甚少。我们前期研究发现转录因子Runx2在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化早期表达增强，但晚期迅速下调并伴随着其蛋白的泛素化增强。 同时我们发现，一种可介导Runx2泛素蛋白酶降解调控的E3泛素连接酶Smurf1的表达趋势恰与之相反。我们推论：1）Runx2的动态表达形式在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中发挥重要作用；2） Smurf1 是牙髓干细胞内调控Runx2表达的一个主要因素；3） Smurf1介导的对Runx2 表达调控可能是诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的关键机制。本课题将利用基因沉默和慢病毒感染以及裸鼠移植等实验验证这些假设，旨在进一步揭示牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化的调控机制，为控制牙髓干细胞的定向分化提供新的策略。

转录因子Runx2在牙齿发育中发挥重要作用，Runx2阶段特异性的表达形式是决定成牙本质细胞分化的重要调控因子。E3泛素连接酶Smurf1通过介导泛素化蛋白降解调控Runx2表达并负调控成骨细胞分化。本课题围绕牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中Smurf1/Runx2通路的调控作用进行一系列研究，旨在明确（1）Runx2动态表达形式在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中发挥重要作用；（2）Smurf1 是牙髓干细胞内调控Runx2表达的一个主要因素；（3）Smurf1介导的对Runx2 表达调控在诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化中发挥重要作用。.我们的研究发现Runx2在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化早期表达增强，但晚期迅速下调，表达形式不同于成骨细胞分化。Runx2knock-down牙髓干细胞成牙本质细胞分化抑制，DSPPmRNA表达，ALP活性以及矿化结节形成降低。进一步实验发现Smurf1knock-down牙髓干细胞Runx2蛋白表达增高，抑制Smurf1表达Runx2蛋白降解半衰期延长，Runx2表达增高，反之亦然。蛋白酶抑制剂Mg132可抑制Runx2蛋白降解，Runx2表达增强。此外，在牙髓干细胞成牙诱导分化14天后Smurf1knock-down使成牙本质细胞基质蛋白DSPP，DMP-1，OCN和BSP表达降低，ALP活性降低但矿化程度明显增强，Smurf1过表达使DSPP和OCN的表达降低，细胞矿化程度降低，而在Smurf1knock-down的牙髓干细胞内抑制Runx2表达,分化诱导后DSPP，DMP-1，OCN和BSP表达以及ALP活性和矿化程度被逆转。但出乎意料的是成牙本质细胞分化过程中Smurf1和Runx2表达形式正相关，在Runx2 knock-down的牙髓干细胞内Smurf1 mRNA 和蛋白表达均降低，Lucifrase reporter assay和CHIP实验发现Runx2可结合Smurf1启动子区特定序列，进而在转录水平调控Smurf1 表达。 .概括而言，本研究首次提出并证明牙髓干细胞内存在Smurf1和Runx2的交互通话，而Smurf1/Runx2反馈通路参与调控牙髓干细胞成牙本质细胞定向分化，该结论不仅拓展原有的成牙本质细胞分化机制中的单线分子调控理论，而且为深入探讨牙髓干细胞分化调控机制提供新的理论基础。