基于“模块途径工程”策略的功能性油脂生物积累机制研究

The rational engineering of oleaginous microorganism to increase lipid content, PUFAs ratio and food safety will promote the industrial production of functional oils. However, the progress in studying mechanism of metabolic regulation for excessive accumulation of lipid in oleaginous microorganism was hampered because of the limited understanding on its genetic manipulation system.Therefore, it is key point how to study the regulating mechanism of lipid accumulation with an host strain having perfect genetic manipulation system. In this project, the assemble lipid accumulating pathway derived from excellent lipid producers will be applied in Saccharomyces cerevisiae according to the modular pathway engineering (MOPE) strategy. The relationship of lipid accumulation related transcription and response elements, the interaction of each module, and the distribution of carbon flux will be figured out by real-time PCR, enzymatic characterization, measurement of the intracellular lipid/PUFAs content and the concentrations of organic acid in the supernatants. The success in revealing the molecular mechanism for lipid accumulation will be valuable for engineering a perfect strain with high lipid productivity and increasingd diversity of PUFAs.

理性改造功能性油脂生产菌株，使之成为兼顾高油脂含量、高比例PUFAs及食品安全性的优良工程菌，为微生物功能性油脂工业化生产注入新动力。功能性油脂天然生产菌株由于遗传操作体系不成熟，造成油脂积累调控机制不清晰，阻碍了对其理性改造的进程。因此，在避开直接对天然生产菌株进行遗传操作的同时，解析油脂积累调控的机制成为我们亟待解决的问题。针对于此，本项目拟基于"模块途径工程"策略，将功能性油脂天然生产菌株油脂积累调控途径中关键模块，导入遗传操作成熟的酿酒酵母，构建用于油脂积累机制分析的重组菌株。通过实时定量PCR、酶学性质表征、胞内油脂含量监测、有机酸分析等方法，明确重组菌中油脂积累调控相关的转录因子与应答元件间的关系、模块之间相互作用的及胞内碳源走向。本研究将解析启动油脂过量积累的机制，对于理性改造产油微生物以提高油脂生产强度、拓展微生物PUFAs品种，最终提高人类健康水平具有重要意义。

功能性油脂天然生产菌株由于遗传操作体系不成熟，造成油脂积累调控机制不清晰，阻碍了对其理性改造的进程。因此，解析功能性油脂积累调控的机制成为我们亟待解决的问题。本项目基于“模块途径工程”策略，围绕以下几方面内容展开研究：一、成功将圆红冬孢酵母菌中的油脂积累模块，包括转录调控因子bZip、苹果酸酶ME、乙酰辅酶A羧化酶ACC整合至酿酒酵母BY4741的代谢途径中，并完成了油脂发酵表型的测定工作。结果表明，分别重组bZip、ME及ACC的酿酒酵母胞内油脂含量相对于出发菌株分别提高了16.7%、34.2%和38.0%，共表达三个基因的重组酿酒酵母油脂含量提高了50.9%，证明转录调控因子bZip能够有效调控油脂合成途径上相关酶的表达，ME能够显著提高油脂合成所需的还原力NADPH，ACC能够加强酿酒酵母体内油脂链的合成；二、构建了重组有圆红冬孢酵母脂肪酸脱毒模块磷脂酸磷酸酶PAH1的酿酒酵母，并考察其对棕榈油酸（C16:1）的耐受性。结果表明，当培养基分别外加0.25 mM和1 mM棕榈油酸时，PAH1重组菌胞内油脂含量的增加程度较之野生菌株有显著提高，说明PAH1能够有效引导C16:1流向二酰甘油（DAG），减轻其对细胞的毒性；三、从头合成α-亚麻酸（ALA）的酿酒酵母基因工程菌的构建。酿酒酵母自身不含有合成ALA所必须的延长酶和去饱和酶系。本工作以之前构建的高油脂含量的酿酒酵母重组菌为出发菌株，从酿酒酵母体内C16：0脂肪酸开始，成功搭建了合成ALA的代谢通路，包括：全基因合成的C16、18 elongase、来源于Mortierella alpina（高山被孢霉）的delta 12 fatty acid desaturase及omega 3 desaturase。利用气相色谱对重组菌所产油脂的脂肪酸成分进行分析，结果表明，重组菌能够有效合成ALA；四、对天然酿酒酵母利用廉价生物质菊粉的机理进行了研究。绝大多数酿酒酵母无法直接以菊粉为唯一碳源进行发酵，阻碍了今后转化廉价生物质生产功能性油脂的研究进程。本工作筛选得到一株有效利用菊粉的酿酒酵母，并证明该菌株高水平表达的蔗糖转化酶SUC2是影响其菊粉利用能力的关键因素。综上，本项目对于理性改造产油微生物以提高油脂生产强度、拓展微生物 PUFAs 品种，最终提高人类健康水平具有重要意义。