中华绒螯蟹Hox基因对短尾化发育的调控模式研究

短尾类甲壳动物在长期的系统进化过程中经历了独特的短尾化改变，中华绒螯蟹个体发育的短尾化发育近似重演了短尾类的系统进化过程。Hox基因家族在节肢动物的形态多样性进化过程中发挥了重要的作用。本项目将采用同源克隆策略和RACE方法，克隆、鉴定中华绒螯蟹的一些Hox基因（Ubx、abd-A和Abd-B基因）；利用染色体步移技术分析启动子结构；通过建立原核表达和真核表达体系来分析其体外功能；通过荧光实时定量PCR、原位杂交与免疫组化等方法检测Hox基因在短尾化发育过程中的表达模式；利用免疫沉淀与蛋白质组学等方法初步分析蛋白互作的靶标；通过建立Abd-B基因的RNAi体系来检测其对短尾化发育的调控作用。预期将初步揭示Hox基因对短尾化发育的调控模式。研究成果可以为短尾类的起源与系统发生研究提供科学依据，对于揭示短尾化的分子机制具有重要意义。

克隆并界定了中华绒螯蟹的Scr（包括Scr-1和Scr-2两个亚基）、Ubx（包括Ubx-1和Ubx-2两个亚基）、EseIF4G、EsHSC70-5、EsHSC70-3、Es14-3-3ζ、EsCP、EsEF1A、EsIsA2、EsPLN、EsDDX10和EsTubulin基因等12个基因的全长cDNA序列，分析了其mRNA在10个幼体发育期的表达谱。Blast结果显示Hox基因Scr和Ubx均具有一个180 bp左右的homeodomain结构。首次发现甲壳动物Hox基因具有基因重复现象。Scr-1和Scr-2基因序列之间、Ubx-1和Ubx-2基因序列之间主要差异均在3’-UTR区，编码框区域只有一个氨基酸的差异。采用新一代测序技术进行了中华绒螯蟹卵至仔蟹III期共10个发育时期的转录组、数字基因表达谱、2个幼体期（大眼幼体期、仔蟹I 期）蛋白质组和4个幼体期（大眼幼体期、仔蟹I 期 、仔蟹II 期、仔蟹III 期）的small RNA高通量测序。通过对转录组数据分析，得到了Total Clean Nucleotides共4,672,927,260 nt的序列数据，其中获得的Unigene为76,112条，Unigene经BLASTX和ESTscan软件分析，有28,129条编码序列，通过GO分析获得了8,001条序列的功能注释；DGE测序结果经测序文库两两比对分析了基因的差异表达情况，得到了各发育时期的共有表达基因和特异表达基因。通过对蛋白质组数据分析，获得Unique peptide为16,549条，蛋白质为4,300，其中差异蛋白为872（大眼幼体期相比于仔蟹I期的上调蛋白为517，下调蛋白为355）；将蛋白质组测序结果与转录组测序结果进行关联分析，能关联上的蛋白质与基因数为1703个，其中具有显著差异的为86个，功能聚类分析显示其主要参与翻译与核糖体结构、生物起源、转录后调控与蛋白质转运、细胞周期调控与细胞分化等。通过对small RNA测序数据分析，获得的clean data reads数为4,200,615，Clean Unique Reads数为242,095条，其中Aligned reads为16,462条。研究成果可以为短尾类的起源与系统发生研究提供科学依据，对于揭示短尾化的分子机制具有重要意义。