福氏志贺菌新亚型基因水平转移分析及其在进化中的作用研究

In recent years, some novel serotypes of Shigella is emerging, which have brought great difficulties to the prevention and contol, digagosis and treatment of shigellosis. Our group have isolated three novel serotypes of shigella flexneri in the diarrhea syndrome monitoring. These serotypes were found with enhanced virulence and more serious multidrug resistance. One of them was demonstrated to have combined properties of Shigella and E. coli by biochemical experiments，which suggests that horizontal gene transfer may be the determinants of phynotypic changes.This study first sequences novel serotypes by next generation sequence technology，assemble and comprehensively annotate the complete genome..The resistance/virulence gene will be analysed and the neighboring species genomic information will be integrated to predict new pathogenic genes.Those novel important pathogenic genes will be further validated using anaimal models.To expore the genetic mechanism of horizontal gene transfer in novel serotypes, methods based on condon usage bias, phylogentic tree and so on will be used. This project aims to take an in-depth study of currently emerging novel serotypes of Shigella flexneri. The implementation of this project will not only help understand the role of horizontal gene transfer in the evolution of novel serotypes, but also promote the establishment of the genetic evolution trend of pathogenic bacterias, and have a very important significance to further improve the monitoring can preventing of novel serotypes of Shigella flexneri in China.

近年来，一些新血清型志贺菌不断出现，这给志贺菌病防控和诊治带来极大困难。本课题组分离鉴定了3种福氏志贺菌新亚型，发现其具有毒力增强和更为严重的多重抗药性特点，其中一株在实验中表现出志贺和大肠杆菌的生化性质，初步分析表明基因水平转移可能是其表型改变的决定因素。本研究拟基于已测定的新亚型菌株基因组框架，进行空缺测序补充，组装得到完整基因组图谱，并全面注释基因组；然后分析新亚型菌株基因组耐药/毒力等致病基因并结合相邻种属基因组信息作出预测，构建新亚型特有致病基因的突变株，通过动物实验对结果进行验证；最后采用序列组成偏性分析、进化树分析等多种方法，探寻新亚型菌株基因水平转移特征，深入分析基因水平转移对新亚型耐药/毒力基因的影响，探究基因水平转移在福氏志贺菌新亚型遗传演化中的作用。通过本项目研究，有助于阐明新亚型菌株致病的分子机制及其演化规律，为我国志贺菌的历史溯源、演化趋势等的研究提供重要参考。

本项目共完成了17株菌株福氏志贺菌新亚型F4y基因组序列测定和拼接；采用2k、6k等大文库测序，结合454及PCR扩增等补充测序，对其中5株F4y菌株基因组和所包含的质粒基因组完整图谱进行了测定和组装。利用RAST注释工具、毒力数据库VFDB、耐药数据库ARDB、插入序列注释工具ISFinder、毒力岛数据库、志贺O抗原基因簇及噬菌体数据库等信息对测序结果进行全面注释，获得了测序菌株的ORF、GC含量、耐药毒力基因等信息。基于建立的肠道病原菌基因组本地数据库和比较基因组分析方法，发现F4y新亚型与其它福氏志贺菌相比新亚型菌株O抗原ugd基因存在46bp的插入序列，且缺失了10k bp的鞭毛基因簇；发现F4y新亚型菌株基因组耐药/毒力等致病基因发生变化，部分菌株缺失了常见的三型分泌系统，但获得了四型菌毛和四型分泌系统；发现F4y菌株tna基因簇与大肠相同，而与其它福氏志贺菌相比上游缺失了插入序列IS1，这可能是新亚型产生吲哚的分子机制，为理解新亚型具备大肠部分表型提供了重要参考。通过PCR扩增和小鼠毒力实验对结果进行验证，表明新毒力因子的获得是F4y菌株毒力增强的重要原因。基于全基因组测序序列，采用序列组成偏性分析、Core-Pan分析和SNP进化树等分析方法，分析发现分泌系统、鞭毛系统、插入序列及毒力岛等均存在较多基因水平转移现象，进化树表明F4y与国内其它型别福氏志贺距离相对较远，表明基因水平转移在新亚型F4y的遗传演化中起到重要的作用。但在进化上不同地方、不同时间分离的F4y仍聚集成簇，表明其与其它福氏志贺菌距离较远，可能来源于较早的分化时间，且不同地方分离F4y菌株之间既有成簇聚集又有进化交叉。通过本项目研究，可为研究我国志贺菌的历史溯源、演化趋势等的提供重要参考。