中华绒螯蟹Dscam基因的细胞吞噬调控机制研究

Dscam regulated phagocytosis has been widely confirmed in arthropod. However, phagocytic regulation mechanism of two significant characteristic that including huge alternative splicing Dscam isoforms inducing pathogens specific recognizing and protein-protein interaction between transmembrane and secreted Dscam are still largely unknown. Based on the preliminary results of our previous study, this project aim to uncover the mechanism of Dscam regulated phagocytosis in Chinese mitten crab via bacterial specific binding and protein synergistic effects. The research content includes: 1) analyze bacterial specific binding function of Dscam isoforms from the perspective of antigen binding sites; 2) define the different phagocytic regulation patterns of transmembrane and secreted Dscam shared bacterial specific binding and cytoplasmic tail that unique to transmembrane Dscam; 3) discover Dscam protein synergistic effects regulated phagocytosis based on pathogens and homophilic binding specificity. This study will enrich our knowledge of Dscam related immune functions, as well as benefit the understanding of phagocytic action mechanism in crustacean.

唐氏综合症细胞黏附分子（Dscam）对节肢动物细胞吞噬的调控已被广泛证实。但是，Dscam大量可变剪切亚型的病原特异性识别以及跨膜型和分泌型Dscam相互作用对吞噬的调控机理尚不明。基于我们的工作基础和前期研究结果，本项目拟从细菌特异性结合及蛋白协同作用层面阐明Dscam调控中华绒螯蟹血细胞吞噬的作用机理。具体内容包括：1）从抗原结合位点的角度聚类分析Dscam亚型的细菌特异性结合能力；2）明确跨膜型和分泌型Dscam共有细菌特异性结合功能及跨膜型Dscam独有细胞质尾对吞噬的调控模式；3）基于异源结合及同源亲和作用探索两种类型Dscam在细胞吞噬调控过程中的协同作用。以上研究将丰富对Dscam免疫功能的认识，并有助于更好的理解甲壳动物细胞吞噬的作用机理。

可变剪接普遍存在于真核生物中，是基因表达调控的重要环节。唐氏综合症细胞黏附分子（Dscam）是可变剪接的代表性基因，在节肢动物中可潜在产生几万种异构体，并与特异性免疫密切相关。本项目对中华绒螯蟹Dscam可变剪接异构体的细菌特异性结合能力及其分子机制，分泌型和跨膜型Dscam在细胞吞噬调控过程中的协同作用进行了研究。我们基于中华绒螯蟹基因组测序结果及大量克隆数据明确了该蟹分泌型Dscam通过3个免疫球蛋白功能域（Ig）及1个跨膜区可潜在产生30,600种可变剪接异构体，基于病原结合表位的生物信息学计算、多肽序列的细菌差异性结合能力，重组蛋白与不同类型细菌的结合等多种方式筛选得到与革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌特异性强结合的Dscam异构体，明确了完整的Ig1 - Ig4功能域是Dscam蛋白完成细菌特异性结合并启动细胞吞噬的结构基础。在此基础上，通过RNAi、激光共聚焦和免疫共沉淀等方式阐明了分泌型Dscam特异性结合病原后以同源亲和作用结合特定跨膜型Dscam为受体完成细胞吞噬的分子机制。上述研究结果明确了分泌型Dscam与细菌特异性结合的分子机制及分泌型Dscam以同源亲和作用结合跨膜型Dscam为受体调控吞噬的作用机理。该研究提升了我们对具有万种可变剪接异构体的Dscam蛋白的特异性免疫功能理解和认知；为深入研究无脊椎动物的免疫训练现象提供了参考。