吲哚信号对牙龈卟啉单胞菌抗生素耐受persisters的调控作用及机制研究

Porphyromonas gingivalis represents the keystone pathogen for periodontitis. It has been recently demonstrated that microbial persisters are critical for recurrence of various clinical infections. Persisters differ from resistant mutants with acquired antimicrobial resistance genes, while they are a special subpopulation presenting high tolerance to antimicrobials through phenotypic switch. We have recently for the first time confirmed that planktonic P. gingivalis can form persisters tolerant to metronidazole, and the levels of persisters are significantly different at exponential or stationary phases, but the underlying mechanisms remain unclear. Indole is a stationary signaling molecule that regulates formation of bacterial persisters. The biological effects of indole on P. gingivalis are poorly understood. As such, two commonly used antimicrobials in periodontal therapy including metronidazole and amoxicillin are selected to establish Pg persister models. This study aims to investigate the effects of indole signaling on formation of planktonic and biofilm persisters of P. gingivalis. Moreover, high throughput proteomics, bioinformatics and gene expression assay are adopted to explore the indole-related modulatory mechanisms and the mechanisms underlying antimicrobial tolerance of stationary and biofilm persisters of P. gingivalis. P. gingivalis persisters are likely to be a crucial mechanism responsible for the persistent infection and inflammation of periodontitis. This study will contribute to further understanding of pathogenicity of P. gingivalis and development of effective therapeutic agents.

牙龈卟啉单胞菌（Pg）是牙周炎的关键致病菌。微生物“存留细胞”（Persisters）是临床感染反复发作的重要原因，其不同于获得抗生素耐药基因的突变菌株，而是通过表型转换形成的对抗生素耐受的特殊亚群。我们前期在国际上首次确认了Pg浮游菌能形成耐受甲硝唑的存留细胞，且在对数期和稳定期存留细胞的水平有显著差异，但潜在机制尚不清楚。吲哚是一种稳定期信号分子，可以调节细菌存留细胞的形成，但对Pg的生物学作用尚不明确。本课题拟选用牙周治疗常用的两种抗生素甲硝唑和阿莫西林，构建Pg存留细胞模型，研究吲哚信号对Pg浮游菌及生物膜中存留细胞产生的调节作用，并通过高通量蛋白质组学、生物信息学及基因表达检测等手段探索吲哚信号的调控机制以及Pg在稳定期和生物膜状态下存留细胞的抗生素耐受机制。Pg存留细胞可能是导致牙周炎持续感染和炎症的一种重要机制，本研究将为进一步阐明Pg的致病机制及开发有效的治疗药物奠定基础。

牙周炎是人类最常见的炎症感染性疾病之一，是成年人失牙的首要原因，且与心脏病、糖尿病等系统性疾病密切相关，显著影响患者的生活质量和全身健康。牙龈卟啉单胞菌（Pg）被视作牙周炎的“关键致病菌”。新近研究证据显示，对抗生素耐受的微生物“存留细胞”（Persisters）是众多感染炎症反复发作和持续的根本原因。然而，Pg是否能够形成persisters及其调节机制尚不清楚。本项目首次证实Pg能够形成对高浓度甲硝唑（MTZ）耐受的persisters，稳定期的Pg比对数期具有更多的persisters。此外，对数期Pg在低浓度氯化血红素（hemin）条件下比在高浓度下persisters水平更高。高通量蛋白质组学分析显示，Pg persisters中一系列与氧化还原状态调节和hemin摄取利用相关的蛋白表达发生显著变化，部分与细胞代谢、转录、DNA合成等生物学通路以及应激反应有关的蛋白也受到调节。Pg persisters的存在提示有必要探索新的治疗策略以有效控制牙周感染及炎症。既往研究表明，低强度的电流具有抑菌作用并且能够增强抗生素的效能。本项目首次发现直流电（DC）可以抑制Pg的粘附和生物膜形成，且对成熟的Pg生物膜具有抑制作用。此外，DC能够增强MTZ和阿莫西林（AMC）对Pg生物膜的杀灭效果。值得注意的是，DC可以促进Pg生物膜细胞内ROS的产生并增强相关基因的表达；同时，DC可以上调药物运输通道蛋白Porin的基因表达。ROC清除剂和Porin基因沉默能够抑制DC及其与MTZ/AMC对Pg生物膜的杀灭作用。本项目的研究表明Pg persisters的存在可能是牙周持续感染和炎症的重要原因，其调节因素和机制的明确有助于开发新的针对细菌persisters的牙周炎治疗策略。DC是一种有潜力的控制Pg相关的牙周/口腔感染的治疗途径，开发临床适用的DC设备将促进牙周炎的防治。