E3泛素连接酶Smurf1的水平及活性调控机制的研究

Smurf1在调控TGFbeta家族信号途径、细胞极性和运动及癌细胞扩散等许多生物学功能中起着重要的作用，然而关于其水平和活性调控机制的报道却非常少见。我们发现Smurf1通过调控RhoA的水平来调节细胞极性，而Smurf1的mRNA水平又被其底物RhoA所调控，形成一个负反馈调节机制，分析发现在Smurf1启动子序列中有血清反应因子SRF的结合位点，而SRF的活性受RhoA所调控，从而初步确立了Smurf1表达的调控途径。另外，我们发现Smurf1有多个丝氨酸位点可以被磷酸化，而且其磷酸化受到TGFbeta受体和蛋白激酶PKCzeta的影响。本课题将在前面的研究基础上，进一步详细探明Smurf1转录调控的分子机理，系统分析并确定Smurf1启动子的应答元件对其转录的调控作用。同时，我们将通过质谱和定点突变的方法来确定其磷酸化位点，从而研究磷酸化对于其底物特异性识别与活性的影响和作用机理。

Smurf1是属于C2-WW-HECT家族的E3泛素连接酶，通过调控多种不同的底物蛋白分子如Smad1、RhoA、MEKK2、RUNX等在TGFbet/BMP家族信号途径的调节、细胞极性和运动、骨发育、以及癌细胞扩散等许多生物学功能中起着重要的作用，然而关于其水平和活性的调控机制的研究报道还很少。过去的研究认为Smurf1识别其底物蛋白主要是通过其WW结构域，而C2结构域和HECT结构域则分别是负责其在细胞内的定位和催化活性的。在本项目的研究中，我们发现Smurf1在调控细胞骨架中，是通过C2结构域来结合其底物蛋白RhoA的，C2结构域的缺失导致Smurf1不能结合RhoA，但不影响Smurf1与Smad1的结合。与之相对应的是我们发现C2结构域的缺失导致Smurf1丧失调控细胞骨架的功能，但是对TGFbeta/BMP信号通路的调节作用却没有影响。进一步的而研究我们发现Smurf1除了能够调控RhoA的降解，还能够调控Rho家族的RhoB降解，却对RhoC没有影响。同时，C2结构域对Smurf1对RhoB的降解也起着非常重要的作用。令人感兴趣的是虽然RhoA和RhoB具有很高的同源性，并且Smurf1对两者的调控机理也很相似，但是Smurf1调控两者降解的细胞生物学意义却又很大的不同。与Smurf1通过调控RhoA降解来影响细胞骨架不同，Smurf1调控的RhoB降解影响了细胞对紫外和烷基化试剂所引起的凋亡的敏感性。在紫外照射或烷基化试剂MMS处理的情况下，Smurf1被上游激酶磷酸化，加速了Smurf1的自身降解，使得RhoB的蛋白水平显著提高，从而促进了细胞的凋亡。因此，我们的结果揭示了Smurf1通过C2结构域识别调控底物蛋白分子RhoA和RhoB的分子机制，并且阐明了在DNA损伤的情况下，细胞通过诱导Smurf1的自身降解来解除其对RhoB分子的抑制作用，从而促进凋亡发生的分子机理。