USP9X/β-catenin互相作用促结肠癌上皮间质转化的机制研究

The epithelial-mesenchymal transition(EMT) of colon cancer cell is closely related with tumor invasion and metastasis. Cytoskeletal protein β-catenin is a crucial signal transduction molecule in cell. It promotes EMT and tumor invasion and metastasis if it is highly expressed in cell nucleus. But the mechanism of β-catenin transferring to cell nucleus is still inconclusive. In our previous study, we found that the expression of USP9X was higher in the colon cancer tissues than in normal colon mucosa. Increased USP9X expression significantly correlated with increased β-catenin protein in colon carcinomas.USP9X interacted with β-catenin by immunoprecipitation. So we will take colon cancer as the target to explore in this study. Firstly, the correlation between expression of USP9X/β-catenin and EMT, tumor invasion and metastasis will be analyzed in colon cancer tissues. Secondly, the deubiquitinase USP9X stabilizing β-catenin which may accumulate and translocate into the cell nucleus will be examined. Thirdly, the transcription complex β-catenin/TCF4/LEF-1 upregulating MMP-9 trascription level of tumor cell will be detected. Thus, colon cancer cells will be lead to EMT and the ability of invasion and metastasis will be enhanced. This project aims to reveal the new molecular mechanisms of EMT in colon carcinoma and provide new target for therapy of colon cancer.

结肠癌上皮间质转化（EMT）与侵袭转移密切相关，细胞骨架蛋白β-连环素（β-catenin）是细胞内重要的信号转导分子，其在细胞核中高表达可以促进肿瘤细胞EMT和侵袭转移，但β-catenin转位入核增加的机制尚未明确。我们前期研究发现，结肠癌组织中去泛素化酶USP9X高表达，与β-catenin的表达存在显著相关关系，免疫共沉淀提示两种蛋白存在相互作用。因此，本项目拟以结肠癌为研究对象，首先检测USP9X/β-catenin的表达对肿瘤细胞EMT和结肠癌侵袭转移的影响；其次探讨USP9X去泛素化稳定β-catenin，增加其核转位在EMT中的作用；再次从分子水平探讨β-catenin/TCF4/LEF-1转录复合体诱导MMP-9高表达与肿瘤细胞EMT的关系；旨在阐释USP9X/β-catenin相互作用促进结肠癌细胞EMT，增强其侵袭转移能力的机制，为探索结肠癌治疗的新靶点奠定理论基础。

结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，死亡率在西方国家恶性肿瘤中居第二位，近二十年来，我国结肠癌发病率增加了两倍。侵袭转移是肿瘤细胞最基本的特征之一，肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)有利于肿瘤侵袭转移。既往研究发现，β-catenin是细胞内重要的信号转导分子，其在细胞核中高表达可以促进肿瘤细胞EMT和侵袭转移，但β-catenin转位入核增加的机制尚未明确。本项目研究发现，在手术切除的108例结肠癌组织和远端正常黏膜组织标本中，结肠癌组织中USP9X、β-catenin和MMP-9阳性表达率显著高于远端正常结肠粘膜组织。统计学分析提示，USP9X/β-catenin/MMP-9在结肠癌组织中的表达具有显著相关关系。单因素和多因素生存分析结果提示USP9X是影响结肠癌预后的独立因子。siRNAs干扰USP9X表达后，CCK-8法检测增殖提示，与空白对照组、si-NC组比较，结肠癌细胞株HCT116和SW480的细胞增殖能力、侵袭能力明显下降；MMP-9和EMT标志物Vimentin表达下调。Realtime-PCR和Western-blot检测发现，siRNAs干扰USP9X表达后，在结肠癌细胞株β-catenin mRNA表达无明显变化，但β-catenin蛋白表达下降。激光共聚焦和免疫共沉淀检测发现，USP9X/β-catenin存在相互作用；siRNAs干扰USP9X表达后，β-catenin入核明显减少；泛素-蛋白酶体抑制剂MG-132可以逆转USP9X siRNA对β-catenin的影响；这显示USP9X在转录后水平调控β-catenin的表达。免疫共沉淀还发现，USP9X调控β-catenin的多聚泛素化，而对β-catenin的单泛素化没有影响。用K48-泛素抗体检测发现，敲除USP9X后，K48-泛素化的β-catenin明显增加。加入USP9X抑制剂WP1130后，K48-泛素化的β-catenin也明显增加。最后，我们还进行了大肠癌细胞的原代培养，并建立了敲除USP9X的稳定转染结肠癌细胞的裸鼠皮下移植瘤模型。结果发现，与对照组比较，敲除USP9X的结肠癌细胞的裸鼠皮下移植瘤的增殖能力明显下降。综上所诉，本研究深入揭示了结肠癌EMT的分子机制，为寻找有效的预防和治疗结肠癌的可能途径奠定理论基础。